[發明專利]一種CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統及其應用

有效

• 申請號: 201610073847.1
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105647968B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 謝安勇;郭濤;馮依力
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6897;C12Q1/6811;C12Q1/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統及其應用，所述測試系統包括：(1)用于表達sgRNA的質粒；(2)用于表達Cas9的質粒；(3)用于測試CRISPR/Cas9基因編輯效率的報告系統；所述報告系統是將能夠編碼有效蛋白的核苷酸片段的C?端與報告基因的N?端拼接，拼接處插入兩個限制性核酸內切酶酶切位點；在利用CRISPR/Cas9系統編輯(敲除)特定基因之前，靶序列的選擇至關重要，這個選擇會影響sgRNA對目的DNA的識別效率、與目的DNA的結合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修復效率，利用本系統可定量比較不同sgRNA–靶DNA序列的基因編輯效率，可以在短時間內確定工作效果最佳的sgRNA，提高實際敲除的成功率，這不僅可以降低工作成本，還可以提高工作效率，推動工作進程。

(一)技術領域

本發明涉及一種CRISPR/Cas9工作效率測試系統及其應用，可在細胞水平上快速、簡便、準確測試由CRISPR/Cas9sgRNA介導的基因編輯效率，篩選可有效用于基因編輯(敲除、突變、敲入)的sgRNA。

(二)背景技術

成簇的、規律間隔的短回文重復序列CRISPR(Clustered RegularlyInterspersed Short Palindromic Repeats)是目前最高效的基因組編輯系統，是從一種來自細菌及古細菌中降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制改造而來。它包含三個元件：Cas9蛋白、crRNA(CRISPR-associated RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)。含有兩個核酸酶結構域(RuvC和HNH)的Cas9蛋白首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過識別和結合靶DNA的PAM(protospacer adjacent motif)基序(5’-NGG-3’)，解旋靶DNA，通過crRNA中的含20堿基的小向導RNA(sgRNA)與單鏈靶DNA堿基配對，形成RNA-DNA復合結構，進而利用Cas9RuvC和HNH核酸酶各自切割靶DNA的一條鏈，形成帶有平末端的DNA雙鏈斷裂。斷裂的DNA要么修復，以保證細胞成活；要么不修復，從而導致細胞死亡。在包括人類細胞的真核細胞中，Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂主要由細胞內兩條保守途徑修復：同源重組(homologous recombination；HR)和非同源末端連接(non-homologous end-joining；NHEJ)。NHEJ會產生刪除、插入，導致基因變異，甚至失活移碼，從而編輯或敲除目的基因。如果能夠提供外源同源序列，HR則可以在選定的DNA靶位上、依照基因靶向原理嵌入目的基因或DNA片段。由于PAM基序結構簡單(5’-NGG-3’)，幾乎可以在所有的基因中都能找到大量靶點，利用Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂及隨后的修復，可以通過這些靶點有效敲除目的基因或者嵌入目的基因或基因片段，因此CRISPR/Cas9技術在基因編輯中潛力巨大，在短短的時間內就已得到了廣泛的應用。目前，CRISPR/Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，在生物、農業、醫學等領域具有巨大的應用潛力和經濟效益。