[發明專利]一種CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統及其應用

有效

• 申請號: 201610073847.1
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105647968B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 謝安勇;郭濤;馮依力
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6897;C12Q1/6811;C12Q1/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述測試系統包括：（1）用于表達sgRNA的質粒；（2）用于表達Cas9的質粒；（3）用于測試CRISPR/Cas9基因編輯效率的報告系統；所述報告系統是將能夠編碼有效蛋白的核苷酸片段的3'-端與報告基因的5'-端拼接，拼接處插入兩個限制性核酸內切酶酶切位點，以便插入sgRNA靶向的目標DNA序列；插入目標序列后后隨的報告基因因為移碼而在細胞中無活性，但當sgRNA引導的CRISPR核酸酶在目標序列對應位點產生DNA雙鏈斷裂時，理論上NHEJ修復會有大約三分之一的機會恢復報告基因的正確編碼而產生活性，從而可以根據報告基因活性水平快速測試sgRNA介導的在目標靶點的CRISPR工作效率。

2.如權利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述能夠編碼有效蛋白的核苷酸片段為滅瘟素脫氨酶基因、新霉素抗性基因、藍色熒光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。

3.如權利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述報告基因為用于檢測的有活性的酶基因或可發光的蛋白基因。

4.如權利要求3所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述報告基因為下列之一：綠色熒光蛋白基因GFP、黃色熒光蛋白基因YFP、青色熒光蛋白基因CFP、藍色熒光蛋白基因BFP、紅色熒光蛋白基因RFP、水母發光蛋白基因、克林霉素基因、螢火蟲熒光素酶基因FLuc、β-半乳糖苷酶基因或酪氨酸酶基因。

5.如權利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述限制性核酸內切酶酶切位點為下列之一：I-SceI、EcoRI、KpnI或BamHI。

6.如權利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統，其特征在于所述報告系統是將滅瘟素脫氨酶基因的3'-端與綠色熒光蛋白基因GFP的5'-端拼接，拼接處插入兩個限制性核酸內切酶酶切位點；所述兩個限制性核酸內切酶酶切位點之一為I-SceI。

7.一種權利要求1所述CRISPR/Cas9工作效率快速測試系統在預測特定sgRNA介導的基因編輯效率中的應用。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述應用方法為：通過分子克隆，在用于測試CRISPR/Cas9基因編輯效率的報告系統的兩個酶切位點之間插入sgRNA靶向的目標DNA序列；然后將表達sgRNA的質粒、表達Cas9的質粒和插入目標DNA序列的報告系統共轉染哺乳動物細胞株，轉染2-3天后，利用流式細胞儀測量GFP陽性細胞的頻率或結合常規雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，利用酶標儀測量螢火蟲熒光素酶基因FLuc和海腎熒光素酶RLuc活性，篩選有效sgRNA，預測所述有效sgRNA在細胞內介導內源基因編輯的效率。

9.一種權利要求1所述用于測試CRISPR/Cas9基因編輯效率的報告系統在檢測和定量突變型非同源末端連接及所產生突變中的應用。

10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述應用是將用于測試CRISPR/Cas9基因編輯效率的報告系統編輯的質粒功能框克隆到小鼠基因組ROSA26位點靶向載體pROSA26上形成載體質粒，再利用ROSA26的定點靶向將所述載體質粒中的功能框完整整合到小鼠胚胎干細胞ROSA26位點，建立突變型非同源末端連接報告細胞，利用建立在細胞中的突變型非同源末端連接報告系統，結合常規的細胞學技術和分子生物學技術，檢測和定量突變型非同源末端連接及所產生突變；所述報告系統的限制性內切酶之一為限制性核酸內切酶I-SceI。