[發明專利]一種基于Indel和SSR位點技術大批量且高效開發分子標記的方法

有效

• 申請號: 201610072778.2
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105695572B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 張殿昌;朱克誠;劉田田;江世貴;張楠;郭華陽
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;馬赟齋

本發明公開了一種基于Indel和SSR位點技術大批量且高效開發分子標記的方法，包括以下步驟：(1)選取至少3個待開發樣品，分別提取待開發樣品的DNA；(2)對各待開發樣品的DNA樣品進行酶切并構建測序文庫并測序；(3)所有待開發樣品的基因組混合后進行組裝獲得Contigs；(4)利用Contigs與各待開發樣品個體序列進行比對，根據Indel和SSR的位點信息，獲得內部存在Indel的SSR位點，作為候選多態性SSR位點；(5)根據獲得的候選多態性SSR位點設計引物，PCR擴增和測序，選取帶型穩定清晰條帶，作為待驗證分子標記引物；(6)利用所得的分子標記引物，PCR擴增不同的待開發樣品，選取具有多樣性的分子標記，獲得分子標記。該方法提高分子標記開發的效率，且開發的SSR分子標記能高效應用于遺傳學、增殖放流評估等方面的研究。

技術領域

本發明涉及分子生物學及生物信息學領域，具體涉及一種基于Indel和SSR位點技術大批量且高效開發分子標記的方法。

背景技術

分子標記是以檢測生物個體在遺傳物質內核苷酸序列變異所產生的差異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。分子標記在不同發育階段的生物個體、不同組織中均一致，并且分子標記的數量越多，多態性越高，遺傳就越穩定，不會受到環境的影響。與傳統的幾種遺傳標記相比較，DNA分子標記具有很多優點。隨著分子生物學的迅猛發展，DNA分子標記已有數十種，廣泛應用于遺傳育種、物種親緣關系的鑒定，群體遺傳多樣性分析，物種增值放流評估等方面。

根據分子標記的發展，可以將其分為三代，第一代以RFLP、AFLP和RAPD為代表；RFLP和AFLP的等位基因具有共顯性特點，但其實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用高；RAPD具有技術簡單，檢測速度快，但其不能鑒別純合子和雜合子，實驗的穩定性和重復性較差；第二代以SSR標記和ISSR為代表，它們以重復序列的重復次數為標記，其特點是易于分型，操作較為簡單，為共顯性標記，便于遺傳分析。第三代分析標記為SNP、Indel標記等這類標記的特點是數量多、范圍廣，便于高通量分析。

SSR標記也稱為微衛星DNA，其串聯重復的核心序列為1-6bp，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。其具有以下優點：一般能檢測到單一的多等位基因位點；呈共顯性遺傳，能區別雜合子和純合子；所需的DNA量少；其缺點是由于創建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發有一定困難，費用也較高，同時篩選引物時有一定盲目性。Indel標記稱為插入缺失標記，指的是兩個樣品中在全基因組中的差異，一個樣品相對于另外一個樣品基因組中有一定數量的核苷酸插入和缺失。根據插入缺失位點，兩端設計一些擴增這些插入缺失位點的引物，就是Indel標記。目前，SSR是應用最多、最廣的分子DNA標記，而Indel標記在水產動物育種中應用甚少。

發明內容

本發明的目的針對物種篩選SSR分子標記時效率不高的問題，提供一種基于Indel和SSR位點技術大批量且高效開發分子標記的方法。用于解決在高通量測序后SSR標記開發有效性較低的問題，該方法可很大程度上提高分子標記開發的效率，且開發的SSR分子標記能高效應用于遺傳學、增殖放流評估等方面的研究，節約了大量的時間和金錢。

本發明的目的通過以下方案來實現：一種基于Indel和SSR位點技術大批量且高效開發分子標記的方法，

(1)選取至少3個待開發樣品，分別提取待開發樣品的DNA；

(2)對各待開發樣品的DNA樣品進行酶切并構建測序文庫并測序；

(3)所有待開發樣品的基因組混合后進行組裝獲得Contigs；

(4)利用Contigs與各待開發樣品個體序列進行比對，檢測出SNP、Indel變異信息以及SSR位點，并根據Indel和SSR的位點信息，獲得內部存在Indel的SSR位點，作為候選多態性SSR位點；