[發(fā)明專利]一種基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610072778.2
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105695572B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張殿昌;朱克誠;劉田田;江世貴;張楠;郭華陽
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/10
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;馬赟齋

1.一種基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)選取至少3個花鱸待開發(fā)樣品，分別提取待開發(fā)樣品的DNA；

(2)對各待開發(fā)樣品的DNA樣品進行酶切并構(gòu)建測序文庫并測序；

(3)所有待開發(fā)樣品的基因組混合后進行組裝獲得Contigs；

(4)利用Contigs與各待開發(fā)樣品個體序列進行比對，檢測出SNP、Indel變異信息以及SSR位點，并根據(jù)Indel和SSR的位點信息，獲得內(nèi)部存在Indel的SSR位點，作為候選多態(tài)性SSR位點；

(5)根據(jù)步驟(4)獲得的候選多態(tài)性SSR位點設(shè)計引物，PCR擴增和測序，選取帶型穩(wěn)定清晰條帶，作為待驗證分子標記引物；

(6)利用步驟(5)所得的分子標記引物，引物序列為SEQ ID No.1-46所示，PCR擴增不同的待開發(fā)樣品，選取具有多樣性的分子標記，獲得分子標記。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述步驟(1)采用Magen DNA提取試劑盒提取待開發(fā)樣品的DNA，進行RAD-seq測序。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述步驟(2)采用限制性內(nèi)切酶EcoRI對基因組DNA樣品進行酶切。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述測序文庫構(gòu)建過程為：酶切后的基因組片段兩端先后拼接P1和P2接頭，經(jīng)過PCR擴增和測序后，篩選獲得含有P1和P2接頭的DNA序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述步驟(3)中，所有待開發(fā)樣品的基因組進行Contigs組裝，采用Stacks軟件進行數(shù)據(jù)分析。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述步驟(3)中利用Illumina HiSeq2000平臺進行測序。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于Indel和SSR位點技術(shù)大批量且高效開發(fā)分子標記的方法，其特征是，所述步驟(4)設(shè)計引物的條件為擴增片段長度為100-300bp，GC含量在40-60％之間。