[發明專利]一種靈敏檢測微量細胞及組織中過氧化氫酶活性的檢測方法

在審

• 申請號: 201610072433.7
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN107022599A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 施冬云;吳美玲
• 申請（專利權）人: 常州萊道斯生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/30
• 分類號: C12Q1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明專利主要涉及使用化學發光法檢測微量細胞及組織中過氧化氫酶的活性。

背景技術

過氧化氫酶是人體內廣泛存在的一種酶，是抗氧化系統的主要組成部分。在病理條件下，我們要無時無刻的防止氧化應激反應，包括癌癥，糖尿病，白內障，動脈粥樣硬化，缺血性再灌注損傷，關節炎，神經退行性疾病，營養缺乏，和老化這些疾病都會引起氧化應激反應。過氧化氫在鐵或其他金屬離子存在下，對細胞產生氧化毒性，而過氧化氫酶催化過氧化氫為氧和水。

臨床實驗室越來越多得檢測血漿和組織中的氧化應激生物標志物和抗氧化系統活性來檢測體內氧化應激水平，作為疾病發展和預后的一個指標。而過氧化氫酶作為抗氧化系統中重要的一種酶，它的活性很大程度上代表了氧化應激的水平。

關于過氧化氫酶活性的測定現主要分為以下幾種：

（1）化學滴定法

化學滴定法是一種最為經典的定量測定方法。過氧化氫酶的化學滴定法主要為高錳酸鉀滴定法和碘量滴定法。根據國家標準GB/T 5522-85，使用高錳酸鉀滴定法具有相對權威性，但是操作過程過于繁瑣。碘量法的原理是利用H2O2能將KI中的I-氧化生成I2，以用淀粉作為滴定終點指示劑，用硫代硫酸鈉滴定，計算出生成I2的量，在換算成H2O2的量。化學滴定法重復性差、緊密度低、操作繁瑣、檢測線低,不適于大批量的樣品測定。其優點是不需要任何特殊的儀器,適用性比較廣泛。

（2）光度法

紫外分光光度法原理是在紫外波長范圍內,隨著波長的縮短, H2O2對光的吸收逐漸增加在240nm處有一個吸收高峰,其吸光度與H2O2的含量成正比,過氧化氫酶能分解過氧化氫,使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。單位時間內吸收的差值就是過氧化氫酶的活性。紫外分光光度法也可采用294nm處波長測定CAT的活性。

目前市場上所應用的過氧化氫酶檢測試劑盒(Catalase Assay Kit)也是利用該方法來計算CAT的活性。隨著科學技術的不斷提高,利用CAT能催化聯苯胺或者四甲基聯苯胺/雙氧水體系而明顯呈藍色的現象,有科研工作者將其應用在CAT活性的檢測上,目前已取得一定的進展。

熒光分析法的原理是以喹啉為底物，經Fenton反應產生的羥自由基與喹啉發生芳香羥基化反應產生強熒光物質羥基喹啉，耦合過氧化氫酶催化分解H2O和O2。該方法操作較紫外分光光度計耗時段，靈敏度高。

化學發光法作為一種高靈敏性檢測過氧化氫-魯米諾產生羥自由基的體系，在特定的pH和底物濃度下快速對過氧化氫酶的活性進行檢測的方法，也已經收到了各方面的重視。

（3）電化學法

電化學法主要采用極譜氧電極法，電流測定法，電泳-染色法。

極譜氧電極法通過氧氣記錄儀檢測過氧化氫分解為氧和水時的氧氣生成量，測定過氧化氫酶的活性，方法簡便靈敏性高，但是對過氧化氫酶提取的要求較高。

電泳染色法利用電泳活性蛋白樣品中過氧化氫酶的活性將過氧化氫分解為水和氧氣，而沒有被分解的過氧化氫則可使三價鐵離子還原為二價鐵離子的過程，通過凝膠背景鑒定過氧化氫酶活性。

（4）放射化學測定法

與滴定法類似，使用同位素標記底物，隨著酶反應的進行定量檢測放射標記產物。

大部分現存的過氧化氫酶檢測方法大都存在檢測方法復雜，檢測所需樣本量較大，樣品提取過程復雜等情況，大部分應用廣泛的方法主要為檢測血液和土壤中微生物過氧化氫酶的活性。胡曉捷,等.流動注射化學發光法測定過氧化氫酶活性[J].浙江大學學報.2003.30.6.”使用魯米諾過氧化氫反應檢測過氧化氫酶活性，雖然靈敏度提高，但該方法主要應用范圍在土壤中對微生物呼吸作用的研究，未在微量組織和細胞上進行測量。。

發明內容

本發明主要針對上述現有技術中檢測CAT活力時，檢測方法復雜，檢測所需樣本量較大，樣品提取過程復雜等問題，提供一種可用于動物細胞和組織中過氧化物酶活力的檢測方法。該方法操作簡便，靈敏度高，可以用于檢測動物細胞及組織在應激及干預后微量的過氧化物酶含量的變化。可檢測到最低20U/ml。

該方法可主要分為以下幾個步驟：

（1）化學發光法檢測動物細胞核組織提取物中過氧化氫酶活性的方法，其特征在于，該方法的步驟和條件如下：

步驟一、取新鮮或超低溫保存的組織和細胞，加入10% NP-40，pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，使用組織勻漿器粗提；