[發明專利]一種磁性海藻酸鈉固化漆酶的制備方法

在審

• 申請號: 201610072431.8
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105505914A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 陳明生;張帆;林大偉
• 申請（專利權）人: 江蘇時空涂料有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公開了一種磁性海藻酸鈉固化漆酶的制備方法，屬于固定化酶制備技術領域。

背景技術

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細菌和植物中。漆酶具有較廣泛的底物專一性和較強的穩定性，能催化許多酚類和芳香胺類物質，如苯酚、對氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺類物質，因而在生物傳感器、生物燃料電池、生物轉化及廢水處理等領域具有廣泛應用。但是由于漆酶易溶于水，在水中游離的漆酶不可回收也不能長期保存，且在高溫或其他極端環境下漆酶的穩定性不易保持，因而限制了漆酶的實際應用。

游離的漆酶因在使用過程中易隨環境的變化變性失活、易混入產品和不易循環利用等使其應用受到限制，對漆酶進行固定化是實現其重復利用、改善其穩定性的有效方法。固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學的方法固定在有機或無機載體上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反應中，它以固相狀態作用于底物，反應完成后，容易與水溶性反應物分離，可反復使用。

固定化技術在保持游離漆酶的專一、高效的催化活性的同時，且比水溶性酶穩定，可較長期使用，更是提高漆酶重復利用性、操控性和穩定性的有效手段，常用的固定化載體包括活性炭、殼聚糖、多孔硅膠以及微濾膜等多種材料，但現有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復雜、分離困難以及操作性不高等缺陷。

發明內容

本發明主要解決的技術問題：針對目前傳統漆酶易溶于水，在水中游離不可回收也不能長期保持，且在高溫或其他極端環境下穩定性不易保持，容易變性失活，因此限制了應用，而常用的固定化技術雖可以保持游離漆酶的催化活性，提高利用率和穩定性，但使用的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復雜、分離困難以及操作性不高等現狀，提供了一種利用產漆菌種發酵制得漆酶酶液，摻加磁性粒子，輔以海藻酸鈉對其固定，振蕩吸附后干燥，從而得到磁性海藻酸鈉固定化漆酶。該方法工藝簡單，成本低廉，制得的磁性海藻酸鈉固定化漆酶不僅活力在250IU/mL以上，總產量也提高至85～90％，均達到了較高水平，而且納米級磁性粒子的摻入使其更容易進行吸附，易于分離，使得固定化漆酶回收率提高，穩定性也得到顯著增強，具有優異的性能。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：

（1）按接種量為培養基底物質量5～7%將白毒鵝膏菌接種到裝有50～100mL基礎液體培養基的300mL三角瓶中，放置在搖床上在25～30℃下以100～200rpm的速率恒溫振蕩培養3～5天，用無菌水淋洗菌絲表面并收集淋洗液，得到菌絲懸浮液，于4～6℃下保存；

（2）向80～100mL基礎液體培養基中分別加入1～2%（w/v）茶葉、1～2%（w/v）豆粕和1～2%（w/v）蔗渣組成的混合物以及5～10mL濃度為0.5mol/L硫酸銅溶液，混合均勻后再加入20～25mL上述制備的菌絲懸浮液，放入恒溫箱在25～35℃下發酵7～8天，再將發酵液移入臥式離心機，以7000～9000r/min轉速離心分離，得上清液即為漆酶酶液，備用；

（3）按摩爾比為3:2將濃度為0.3mol/L氯化鐵和0.2mol/L氯化亞鐵溶液混合均勻，取100～200mL混合液裝入300mL三口燒瓶中，用質量濃度為17%氨水調節pH至9～10后，向燒瓶中以10mL/min速率持續通入氮氣并移入水浴鍋中，升溫至75～85℃保溫熟化30～40min，在磁場作用下吸附分離，得納米級磁性粒子；

（4）取1～3g納米級磁性粒子在超聲作用下分散于40～50mL濃度為10%海藻酸鈉溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200～300mL蓖麻油并移入高剪切乳化機，以12000～13000r/min轉速進行乳化，在乳化過程中再逐滴滴入5～10mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完畢后繼續乳化5～10min；

（5）乳化結束后將乳化液倒入400～500mL質量濃度為5%氯化鈣溶液中，用攪拌棒攪拌均勻后靜置沉淀過夜，再過濾分離得到沉淀物，將得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液沖洗1～2h，放入烘箱在105～110℃下干燥至恒重；

（6）稱取20～30g上述沖洗干燥后的烘干物放入裝有300～500mL步驟（2）制備的漆酶酶液的漩渦振蕩儀中，以30～50W功率在30～40℃下振蕩吸附12～24h后濾出，真空干燥后即得一種磁性海藻酸鈉固化漆酶。

所述的基礎液體培養基是由1～1.2L馬鈴薯浸出液、15～25g葡萄糖、2～3g蛋白胨、3～5g磷酸二氫鉀和2～4g硫酸鎂混合而成。