[發明專利]雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法及應用、用其制備熒光免疫層析試劑條的方法

在審

• 申請號: 201610072237.X
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105738616A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 金晶;黃力;杜騰飛;羅雅賽;蘇恩本
• 申請（專利權）人: 基蛋生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 陳書華

技術領域

本發明屬于熒光免疫層析體外診斷中的熒光標記領域，具體涉及一種雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法及應用、用其制備熒光免疫層析試劑條的方法。

背景技術

免疫檢測技術是目前醫學、生物學、食品安全等領域最基本也是最常用的檢測手段之一，該技術基于抗體與抗原間特異性反應原理對待測物進行定性定量分析，廣泛應用于醫學生物學基礎研究、醫學臨床、環境監測、疾病診斷、疾病發展預測甚至是食品和微生物污染的檢測中。

熒光免疫分析技術是利用熒光物質標記抗原或抗體分子，通過與待測物分子特異性免疫結合后檢測熒光信號的強度變化，實現對目標分析物的定性和定量判斷。

在進行免疫檢測或者是熒光免疫分析過程中，低濃度的抗原的檢測依然是臨床診斷和檢驗檢疫領域的重大問題，上述分析方法在應對非常微量的物質檢測時，經常存在信號低、噪聲干擾大、傳統方法難以檢出的難題，因此，發展新的免疫標記技術或新的檢測手段，提高檢測靈敏度是目前分析檢測領域發展的迫切要求。

目前，在熒光免疫分析領域，常用的放大手段包括生物素～親和素放大體系，1981年，Hsu等證明了一個親合素可以同時結合四個生物素分子，并對兩者在免疫學中應用的方法做了詳細介紹，通過鏈親合素～生物素的橋接作用，分別結合抗原抗體、標記物質或熒光微球等，能極大地增強抗體結合量或熒光結合量，起到放大的作用。

中國專利CN201310470907X介紹了一種信號放大型熒光探針及其制備方法及應用，其中一種放大方式即是利用生物素和親合素直接的結合作用實現的，但是該方法僅僅針對抗體結合量的增加和放大，在面對某些更微量的指標檢測時檢測低值可能不能檢出。

一般的生物素、親合素放大體系均采用的是一種放大模式，僅僅利用到生物素和親合素間的放大效果，不能有效將生物素和親合素放大模式充分利用起來，往往在面對一些痕量檢測時會顯得束手無策。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足而提供一種雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法及應用、用其制備熒光免疫層析試劑條的方法，該雙重放大熒光免疫標記探針利用增強熒光強度和增加探測分子結合量兩種放大模式，使得熒光免疫檢測試劑盒熒光強度較以往有更大的放大倍數，檢測低值大大降低，實現痕量檢測。

本發明技術方案如下：

雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：取購置的活化生物素，其中四分之一的活化生物素同待測物質探測分子進行混合反應，四分之三的活化生物素同載體進行混合反應，均室溫下攪拌1～2小時，然后在PBS緩沖液透析袋中透析48～72小時，得生物素化待測物質探測分子和生物素化載體，其中PBS緩沖液的摩爾濃度為10mM，pH為7.4；

步驟二：取步驟一制得的生物素化載體，用NaHCO₃調節pH至8～9后，加小分子熒光染料，室溫攪拌反應1～2小時，反應結束后，用純化樹脂除去未反應的小分子熒光染料，再加入熒光微球，室溫攪拌反應1～2小時，于1100g下離心3～5分鐘，收集離心后溶液，獲得修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球；

步驟三：將步驟二制得的修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球與鏈親和素混合，室溫反應1～2小時，加入步驟一制得的生物素化待測物質探測分子，繼續反應1～2小時，即得所述雙重放大熒光免疫標記探針。

更進一步的，所述的雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，其中步驟一中所述待測物質為抗原或抗體類蛋白質或多肽，所述載體為牛血清白蛋白、酪蛋白或超支化聚合物類物質。

更進一步的，所述的雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，其中步驟一中所述活化的生物素、待測物質探測分子、載體的摩爾比為4：1：3。

更進一步的，所述的雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，其中步驟二中所述生物素化載體、熒光微球的摩爾比為1：1。

更進一步的，所述的雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，其中步驟二中所述NaHCO₃溶液的質量濃度為10％，所述小分子熒光染料同熒光微球熒光光譜相同。

更進一步的，上述的雙重放大熒光免疫標記探針的制備方法，其中步驟三中所述修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球、鏈親和素、生物素化待測物質探測分子的摩爾比為1：5：5。

用所述的雙重放大熒光免疫標記探針制備檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的熒光免疫層析試劑條的方法，包括如下制備步驟：