[發(fā)明專利]雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法及應(yīng)用、用其制備熒光免疫層析試劑條的方法

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• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105738616A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金晶;黃力;杜騰飛;羅雅賽;蘇恩本
• 申請（專利權(quán)）人: 基蛋生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 陳書華

1.雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：取購置的活化生物素，其中四分之一的活化生物素同待測物質(zhì)探測分子進(jìn)行混合反應(yīng)，四分之三的活化生物素同載體進(jìn)行混合反應(yīng)，均室溫下攪拌1～2小時，然后在PBS緩沖液透析袋中透析48～72小時，得生物素化待測物質(zhì)探測分子和生物素化載體，其中PBS緩沖液的摩爾濃度為10mM，pH為7.4；

步驟二：取步驟一制得的生物素化載體，用NaHCO₃調(diào)節(jié)pH至8～9后，加小分子熒光染料，室溫攪拌反應(yīng)1～2小時，反應(yīng)結(jié)束后，用純化樹脂除去未反應(yīng)的小分子熒光染料，再加入熒光微球，室溫攪拌反應(yīng)1～2小時，于1100g下離心3～5分鐘，收集離心后溶液，獲得修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球；

步驟三：將步驟二制得的修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球與鏈親和素混合，室溫反應(yīng)1～2小時，加入步驟一制得的生物素化待測物質(zhì)探測分子，繼續(xù)反應(yīng)1～2小時，即得所述雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，步驟一所述待測物質(zhì)為抗原或抗體類蛋白質(zhì)或多肽，所述載體為牛血清白蛋白、酪蛋白或超支化聚合物類物質(zhì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，步驟一中所述活化的生物素、待測物質(zhì)探測分子、載體的摩爾比為4：1：3。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，步驟二中所述生物素化載體、熒光微球的摩爾比為1：1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，步驟二中所述NaHCO₃溶液的質(zhì)量濃度為10％，所述小分子熒光染料同熒光微球熒光光譜相同。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針的制備方法，其特征在于，步驟三中所述修飾生物素和小分子熒光染料的熒光微球、鏈親和素、生物素化待測物質(zhì)探測分子的摩爾比為1：5：5。

7.用權(quán)利要求1制得的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針制備檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的熒光免疫層析試劑條的方法，其特征在于，包括如下制備步驟：

步驟一：樣品墊的制備：用緩沖液溶解蛋白，加入表面活性劑，其中，每100mL緩沖液加入0.01～0.05g表面活性劑，調(diào)節(jié)pH為6～8，以每30cm長樣品墊使用2～5ml上述液體的比例，將上述溶液均勻涂布在樣品墊上，20～25℃干燥8～12小時即可；

步驟二，結(jié)合墊的制備：與步驟一處理樣品墊的方式相同，先對結(jié)合墊進(jìn)行處理，后將制備的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針用PBS緩沖液稀釋3000倍，均勻的噴于結(jié)合墊上，于20～25℃干燥4～8小時即可，其中，所述PBS緩沖液的摩爾濃度為10mM，pH為7.4，含2％BSA和2％蔗糖；

步驟三，硝酸纖維素膜的處理：

A.檢測線的制備：將心肌肌鈣蛋白I相對應(yīng)的捕獲單克隆抗體或多克隆抗體用20mmol/L、pH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/mL的濃度，0.8ul/cm在硝酸纖維素膜上劃線得檢測線，干燥箱內(nèi)20～25℃鼓風(fēng)干燥8～12h即得；

B.質(zhì)控線的制備：兔抗鼠IgG抗體按4mg/mL的濃度，0.8ul/cm在硝酸纖維素膜上劃質(zhì)控線，該線與檢測線間隔平行，干燥箱內(nèi)20～25℃鼓風(fēng)干燥8～12h即得；

步驟四，吸水墊的制備：吸水紙裁剪成30*2.7cm每條，即可；

步驟五，組裝：將所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊順次貼在底板上，其中，樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間需重迭1～2mm，后用斬切機切成一定寬度的試劑條，20～25℃鼓風(fēng)干燥8～12h，即得所述熒光免疫層析試劑條。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針制備檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的熒光免疫層析試劑條的方法，其特征在于，步驟一中所述緩沖液為10mM，pH為7.2～7.4的PBS，Tris或甘氨酸緩沖液，用所述緩沖液溶解5mg/mL的BSA或酪蛋白。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針制備檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的熒光免疫層析試劑條的方法，其特征在于，步驟一中所述表面活性劑為吐溫20或聚乙二醇辛基苯基醚。

10.權(quán)利要求1所述的雙重放大熒光免疫標(biāo)記探針在熒光免疫檢測中的應(yīng)用。