[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610071733.3
• 申請(qǐng)日: 2016-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN105717082A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管曉翔;楊芳;李權(quán);張文文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 管曉翔
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N1/06;G01N1/30;G01N1/44
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)因子領(lǐng)域，尤其涉及定量檢測(cè)乳腺癌患者瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法，具體的說，是一種用于檢測(cè)三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法。

背景技術(shù)

乳腺癌是常見惡性腫瘤之一。根據(jù)WHO最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)每年新發(fā)女性乳腺癌患者約18萬，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率第二，其治療和預(yù)后預(yù)測(cè)受到大家的廣泛關(guān)注。

乳腺癌是一種異質(zhì)性很高的疾病，其預(yù)后與不同亞型（ER、PR、HER-2受體狀態(tài)）、腫瘤分期、增殖指數(shù)（Ki-67）、組織學(xué)分級(jí)等因素密切相關(guān)。然而在以上因素一致的情況下，尤其對(duì)于ER、PR、HER-2均為陰性的三陰性乳腺癌（TNBC）這一預(yù)后最差的乳腺癌亞型，不同患者間的預(yù)后仍存在差異。因此人們?cè)诓粩嗵剿餍碌摹⒂行У念A(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，以準(zhǔn)確判斷患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)調(diào)整治療策略。

除了不同亞型的乳腺癌治療和預(yù)后存在差異，腫瘤內(nèi)部也具有很高的異質(zhì)性，且有研究表明，腫瘤的瘤內(nèi)異質(zhì)性與疾病的診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)。例如，同一患者不同部位的腫瘤組織熒光原位雜交檢測(cè)HER-2擴(kuò)增結(jié)果可能不一致，這有可能會(huì)影響臨床檢測(cè)的結(jié)果和治療方案的制定。因此評(píng)估乳腺癌的異質(zhì)性顯得尤為重要。然而，目前尚沒有統(tǒng)一的定量檢測(cè)腫瘤瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法，且目前大多數(shù)研究方法存在以下不足：

1.針對(duì)腫瘤內(nèi)部的這種空間異質(zhì)性，臨床常需要多點(diǎn)取材，然后對(duì)單個(gè)樣品分別進(jìn)行基因分子水平的分析，整個(gè)過程時(shí)間成本、經(jīng)濟(jì)成本、人力成本均大大增高，同時(shí)也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)誤差。

2.目前較為先進(jìn)的探究瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法包括全基因表達(dá)譜、全基因組或外顯子測(cè)序，甚至有的進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，以上方法經(jīng)濟(jì)成本和技術(shù)要求極高，大范圍推廣和普及很難實(shí)現(xiàn)，缺乏實(shí)用性。

3.目前通過瘤內(nèi)異質(zhì)性判斷腫瘤預(yù)后沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且尚未在三陰性乳腺癌中加以應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、誤差小、能對(duì)多組樣本同時(shí)檢測(cè)的用于檢測(cè)三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的裝置及方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于檢測(cè)三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的方法，其特征是：包括以下步驟：

步驟一、三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性檢測(cè)芯片的制作：

1)制作受體蠟塊：

在石蠟包埋機(jī)下，用模具制備受體蠟塊；采用組織取樣針在受體蠟塊上打孔，相鄰孔芯之間具有一定間隙，使孔芯在受體蠟塊上形成微陣列；

2)供體蠟塊取材：

收集數(shù)組所需檢測(cè)的三陰性乳腺癌組織及配對(duì)正常組織石蠟標(biāo)本作為供體蠟塊；每組供體蠟塊制切片后均進(jìn)行H&E染色，觀察組織結(jié)構(gòu)典型的乳腺癌區(qū)，并在玻片上圈出，對(duì)照H&E染色切片，在供體蠟塊相應(yīng)部位上作出標(biāo)記；在組織芯片制作儀上用同一直徑的取樣針對(duì)供體蠟塊標(biāo)記部位進(jìn)行取樣，一組取數(shù)個(gè)不同位置的癌組織和一個(gè)正常對(duì)照組織的組織芯；

3)瘤內(nèi)異質(zhì)性組織芯片制作：

將每組供體蠟塊上取得的組織芯按一定排布規(guī)律，垂直塞入受體蠟塊對(duì)應(yīng)位置的空白孔芯中；將做好的組織芯片放回蠟塊模中，加熱至半熔后，將組織芯片冷卻，再加熱至半熔，重復(fù)數(shù)次，使組織芯與受體蠟塊緊密結(jié)合；然后將組織芯片表面修平；將組織芯片切片并進(jìn)行H&E染色，再次確認(rèn)取材點(diǎn)是否與供體蠟塊標(biāo)記的目標(biāo)區(qū)域相同；

步驟二、多探針聯(lián)合熒光原位雜交：

1)探針選擇：采用兩個(gè)雙色探針和一個(gè)單色探針進(jìn)行三陰性乳腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的檢測(cè)；每個(gè)探針單獨(dú)進(jìn)行熒光原位雜交，步驟相同，具體如下：

a、切片預(yù)處理：將制作好的組織芯片切片，將切好的白片保溫，過夜；次日室溫二甲苯中脫蠟，再對(duì)切片浸洗處理，自然晾干玻片；

b、變性雜交：避光下滴加探針覆蓋切片目標(biāo)區(qū)域，加蓋蓋玻片并用樹脂膠封邊，放入雜交儀過夜；

c、洗滌復(fù)染：避光下取出玻片，揭去封膠，室溫浸于SSC液中使蓋玻片自然脫落，對(duì)玻片浸洗處理，自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于熒光顯微鏡下觀察并拍照；

步驟三、計(jì)算瘤內(nèi)異質(zhì)性

1)每個(gè)點(diǎn)計(jì)數(shù)多個(gè)輪廓清晰、與周圍細(xì)胞沒有重疊、熒光信號(hào)清晰的細(xì)胞，記錄下每個(gè)細(xì)胞內(nèi)部紅色信號(hào)和綠色信號(hào)的個(gè)數(shù)，每個(gè)細(xì)胞可計(jì)算其拷貝比值；

2)將每組細(xì)胞的信息進(jìn)行匯總，計(jì)算每組的瘤內(nèi)異質(zhì)性指數(shù)，具體公式為：

H’=-∑piln(pi),