[發明專利]一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法

在審

• 申請號: 201610071733.3
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105717082A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 管曉翔;楊芳;李權;張文文
• 申請（專利權）人: 管曉翔
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/06;G01N1/30;G01N1/44
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法，其特征是：包括以下步驟：

步驟一、三陰性乳腺癌瘤內異質性檢測芯片的制作：

1)制作受體蠟塊：

在石蠟包埋機下，用模具制備受體蠟塊；采用組織取樣針在受體蠟塊上打孔，相鄰孔芯之間具有一定間隙，使孔芯在受體蠟塊上形成微陣列；

2)供體蠟塊取材：

收集數組所需檢測的三陰性乳腺癌組織及配對正常組織石蠟標本作為供體蠟塊；每組供體蠟塊制切片后均進行H&E染色，觀察組織結構典型的乳腺癌區，并在玻片上圈出，對照H&E染色切片，在供體蠟塊相應部位上作出標記；在組織芯片制作儀上用同一直徑的取樣針對供體蠟塊標記部位進行取樣，一組取數個不同位置的癌組織和一個正常對照組織的組織芯；

瘤內異質性組織芯片制作：

將每組供體蠟塊上取得的組織芯按一定排布規律，垂直塞入受體蠟塊對應位置的空白孔芯中；將做好的組織芯片放回蠟塊模中，加熱至半熔后，將組織芯片冷卻，再加熱至半熔，重復數次，使組織芯與受體蠟塊緊密結合；然后將組織芯片表面修平；將組織芯片切片并進行H&E染色，再次確認取材點是否與供體蠟塊標記的目標區域相同；

步驟二、多探針聯合熒光原位雜交：

探針選擇：采用兩個雙色探針和一個單色探針進行三陰性乳腺癌瘤內異質性的檢測；每個探針單獨進行熒光原位雜交，步驟相同，具體如下：

切片預處理：將制作好的組織芯片切片，將切好的白片保溫，過夜；次日室溫二甲苯中脫蠟，再對切片浸洗處理，自然晾干玻片；

b、變性雜交：避光下滴加探針覆蓋切片目標區域，加蓋蓋玻片并用樹脂膠封邊，放入雜交儀過夜；

c、洗滌復染：避光下取出玻片，揭去封膠，室溫浸于SSC液中使蓋玻片自然脫落，對玻片浸洗處理，自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于熒光顯微鏡下觀察并拍照；

步驟三、計算瘤內異質性

1)每個點計數多個輪廓清晰、與周圍細胞沒有重疊、熒光信號清晰的細胞，記錄下每個細胞內部紅色信號和綠色信號的個數，每個細胞可計算其拷貝比值；

2)將每組細胞的信息進行匯總，計算每組的瘤內異質性指數，具體公式為：

H’=-∑piln(pi),

其中pi代表第i個拷貝值的細胞在所有細胞中所占的比例；每組將三個探針的H’求和得出總的瘤內異質性指數H。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法，其特征是：步驟一中制作的受體蠟塊用于制備尺寸為25.0mm×23.8mm×5.0mm的組織芯片，組織取樣針直徑為1.0mm，組織取樣針在受體蠟塊上打孔深度約為0.4cm，每兩個相鄰孔芯的間距約2.0mm，制備成8行×8列的微陣列。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法，其特征是：步驟一中收集十六組所需檢測的三陰性乳腺癌組織及配對正常組織石蠟標本作為供體蠟塊，對供體蠟塊標記部位進行取樣時，一組取三個不同位置的癌組織和一個正常對照組織的組織芯，四個樣本在受體蠟塊上從左到右依次相鄰排列在同一行，十六組組織芯填滿受體蠟塊的8行×8列的微陣列。

4.根據權利要求1所述的一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法，其特征是：步驟一中組織芯塞入受體蠟塊的空白孔芯中后，將做好的組織芯片放回蠟塊鉛模中，放入56℃烤箱加熱20min至半熔，在將組織芯片取出在室溫下自然冷卻，再放入烤箱加熱，重復上述步驟3次，最后用石蠟切片機將組織芯片表面修平。

5.根據權利要求1所述的一種用于檢測三陰性乳腺癌瘤內異質性的方法，其特征是：步驟二中采用的兩個雙色探針為EGFR/CEP7探針和CCND1/CEP11探針，單色探針為MYC探針。