[發明專利]鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白及制備方法與應用

有效

• 申請號: 201610070599.5
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105541977B
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 程安春;高群;汪銘書;朱德康;楊喬;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 王貴君

本發明公開了一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白及制備方法與應用，屬于生物工程領域。本發明的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；然后利用基因工程技術，在其進行克隆的基礎上，將其與原核表達載體pET?32a(+)連接，成功轉化大腸桿菌BL21(DE3)表達系統進行誘導、表達的基因工程產品；該蛋白的表達形式是OmpHM/His融合蛋白，表達的融合蛋白分子量為28kDa，將產品設計為融合表達主要是考慮便于純化；同時表達蛋白保持蛋白的天然活性。產品可應用于檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的間接ELISA方法的檢測抗原，也可作為預防鴨疫里默氏桿菌的基因工程亞單位疫苗。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白及制備方法與應用。

背景技術

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一種革蘭氏陰性菌，歸于黃桿菌科(Flavobacteriaceae)，是鴨疫里默氏桿菌病的病原體，能夠引起鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種慢性或急性敗血癥狀的接觸性傳染疾病，呈世界性分布，發病率和死亡率高，已成為目前嚴重危害養鴨業的主要傳染病之一。該病主要的臨床癥狀主要表現為精神沉郁，癱地、縮頸、拉黃綠色稀便等癥狀。病變特征是引起宿主的纖維素性氣囊炎、腦膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性輸卵管炎，并伴有不同程度的敗血癥，對養殖業的發展存在著巨大的威脅。

目前已建立的用于檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體的方法有瓊脂擴散實驗、凝集試驗、ELISA等，這些檢測方法或是靈敏度、特異性不高，或是由于使用抗原成分的不同而存在一些不足；而鴨疫里默氏桿菌的防治主要是抗生素進行治療或用菌體疫苗來對相應血清型感染進行預防。OmpH屬于孔蛋白，目前未見鴨疫里默氏桿菌OmpH研究和應用的相關研究報道。

發明內容

為克服現有技術存在的缺點與不足，本發明的目的之一在于提供一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白，該蛋白能作為鴨疫里默氏桿菌抗體的捕獲劑等。

本發明的目的之二在于提供上述鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的制備方法，該方法可用于OmpH截段重組蛋白的大規模生產。

本發明的目的之三在于提供上述制備獲得的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

上述的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：

A、以RA-CH-1基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的上、下游引物PCR擴增得到鴨疫里默氏桿菌OmpH截段基因片段(OmpHM)，與pMD19-T(simple)的連接，得pMD19-OmpHM；

B、用限制性內切酶BamH I和Xho I分別雙酶切pMD19-OmpHM質粒和原核表達載體pET32a(+)，進行連接，得重組原核表達質粒pET32a-OmpHM；

C、將步驟B提取的重組質粒pET32a-OmpHM轉化到表達宿主菌誘導表達，得鴨疫里默氏桿菌截段重組蛋白粗品。

進一步，將步驟C所得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白粗品經鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后，得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白；

進一步，步驟C中的宿主菌為菌株BL21(DE3)，在IPTG濃度＝1.2mmol/L，誘導溫度為25℃條件下進行誘導表達9小時，得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白。