[發明專利]一種馬鈴薯Y病毒屬病毒中和表位鑒定方法及其應用

在審

• 申請號: 201610070080.7
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105588942A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 王永志;蘇穎;李啟云;李小宇;張春雨
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明涉及植物病理研究技術領域，尤其涉及一種馬鈴薯Y病毒 屬病毒中和表位鑒定方法及其應用。

背景技術

植物病毒病導致每年200億美元的經濟損失。隨著氣候的變化、 種植模式的改變和經濟活動的全球化，植物病毒病的危害逐年增加。 植物抗體(Plantibody)是通過遺傳工程手段在植株內表達的重組抗 體，植物抗體技術在植物抗病研究中的應用還處在起步階段。關于植 物病毒中和表位鑒定方法還未見報道。

馬鈴薯Y病毒屬(genusPotyvirus)是已確定的植物病毒屬中最 大的一類，有約200個種類被ICTV接受為確定成員或可能成員，占 已發現的植物病毒總數的20％，且新成員數量仍在不斷增加，是種 類最多、寄主范圍最廣、經濟意義最大的病毒屬，代表毒株有大豆花 葉病毒(SoybeanMosaicVirus,SMV)和馬鈴薯Y病毒(PotatoVirus Y,PVY)等，其基因組末端編碼病毒的衣殼蛋白(CoatProtein,CP)。 大豆花葉病毒病是大豆的主要病害，不僅影響大豆產量而去影響大豆 品種，目前還沒有有效的防治手段，為此我們提出了一種馬鈴薯Y病 毒屬病毒中和表位鑒定方法及其應用。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種馬鈴薯Y病毒 屬病毒中和表位鑒定方法及其應用。

本發明提出的一種馬鈴薯Y病毒屬病毒中和表位鑒定方法及其 應用，該鑒定方法包括以下步驟：

S1，準備材料：準備好實驗室保存的大腸桿菌DH5α菌株、Rosseta 菌株、大豆花葉病毒和馬鈴薯Y病毒等馬鈴薯Y病毒屬代表毒株、 SP2/0細胞，BALB/c小鼠，購自大連寶生物公司的限制性內切酶、反 轉錄酶、T4DNA連接酶、EX-TagDNA聚合酶，購自美國GE公司的異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷、Ni²⁺離子親和層析柱，購自Sigma公司的 HRP標記的羊抗鼠酶標抗體；

S2，馬鈴薯Y病毒屬衣殼蛋白(CP)基因的克?。焊鶕礼enBank 中已有的馬鈴薯Y病毒屬基因序列設計CP基因的特異性引物，以 TRIzol法抽提病毒感染植物組織總RNA，用M-MuLV反轉錄酶42℃ 作用1h合成cDNA第一鏈，以此為模板用EX-TaqDNA聚合酶擴增CP 基因，其中的反應條件為94-95℃預變性1-3min；93-95℃變性 15-20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，進行30個循環；72℃再延伸 10min，PCR產物經凝膠純化回收，與pMD18-T載體連接，轉化大腸 桿菌DH5α感受態細胞，構建重組質粒pMD-CP；

S3，原核表達載體的構建：NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒pMD-CP 和原核表達載體pET-28a(+)，凝膠純化回收目的片段，將CP基因與 pET-28a(+)連接，構建重組質粒pET28a-CP，分別轉化大腸桿菌 DH5α，經PCR鑒定和酶切鑒定后，進行測序；

S4，重組CP蛋白的鑒定：將重組質粒pET28a-CP轉化至大腸桿 菌BL21，挑取單個菌落進行鑒定后擴增繁殖，采用不同的IPTG濃度、 誘導時間、誘導溫度、誘導前測D600nm值、培養基抗生素濃度進行 誘導表達，優化誘導條件，比較不同表達載體以及不同表達條件的表 達量，確定最佳誘導條件，同時設立含pET-28a(+)空載體的表達 菌作為對照；

S5，重組CP蛋白的純化：采用優化的表達條件進行大量表達， 收獲菌體，凍融3次，用PBS懸浮菌體沉淀，在3-5℃的條件下 4500r/min離心9-11min，包涵體沉淀用3mol/L尿素溶液洗去大部分 雜蛋白，在4℃的條件下4500r/min離心10min，包涵體沉淀用pH＝8.0 含8mol/L尿素的裂解液室溫溶解1h，在4℃的條件下12000r/min離 心20min，取上清蛋白與Ni2+-NTA填料結合0.5-1.5h，分別用pH＝8.0、 6.3、5.9的8mol/L尿素溶液洗滌去雜蛋白后，用pH＝4.5的8mol/L 尿素溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫的目的蛋白，進行SDS-PAGE鑒定；