[發(fā)明專利]一種馬鈴薯Y病毒屬病毒中和表位鑒定方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610070080.7
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105588942A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王永志;蘇穎;李啟云;李小宇;張春雨
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京國智京通知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

1.一種馬鈴薯Y病毒屬病毒中和表位鑒定方法及其應(yīng)用，其特 征在于，該鑒定方法包括以下步驟：

S1，準備材料：準備好實驗室保存的大腸桿菌DH5α菌株、Rosseta 菌株、大豆花葉病毒和馬鈴薯Y病毒等馬鈴薯Y病毒屬代表毒株、 SP2/0細胞，BALB/c小鼠，購自大連寶生物公司的限制性內(nèi)切酶、反 轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA連接酶、EX-TagDNA聚合酶，購自美國GE公司的異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷、Ni²⁺離子親和層析柱，購自Sigma公司的 HRP標記的羊抗鼠酶標抗體；

S2，馬鈴薯Y病毒屬衣殼蛋白(CP)基因的克?。焊鶕?jù)GenBank 中已有的馬鈴薯Y病毒屬基因序列設(shè)計CP基因的特異性引物，以 TRIzol法抽提病毒感染植物組織總RNA，用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶42℃ 作用1h合成cDNA第一鏈，以此為模板用EX-TaqDNA聚合酶擴增CP 基因，其中的反應(yīng)條件為94-95℃預(yù)變性1-3min；93-95℃變性 15-20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，進行30個循環(huán)；72℃再延伸 10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化回收，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-CP；

S3，原核表達載體的構(gòu)建：NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-CP 和原核表達載體pET-28a(+)，凝膠純化回收目的片段，將CP基因與 pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CP，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后，進行測序；

S4，重組CP蛋白的鑒定：將重組質(zhì)粒pET28a-CP轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌BL21，挑取單個菌落進行鑒定后擴增繁殖，采用不同的IPTG濃度、

誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、菌液濃度、培養(yǎng)基抗生素濃度進行誘導(dǎo)表 達，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，比較不同表達載體以及不同表達條件的表達量， 確定最佳誘導(dǎo)條件，同時設(shè)立含pET-28a(+)空載體的表達菌作為 對照；

S5，重組CP蛋白的純化：采用優(yōu)化的表達條件進行大量表達， 收獲菌體，凍融3次，用PBS懸浮菌體沉淀，在3-5℃的條件下 4500r/min離心9-11min，包涵體沉淀用3mol/L尿素溶液洗去大部分 雜蛋白，在4℃的條件下4500r/min離心10min，包涵體沉淀用pH＝8.0 含8mol/L尿素的裂解液室溫溶解1h，在4℃的條件下12000r/min離 心20min，取上清蛋白與Ni2+-NTA填料結(jié)合0.5-1.5h，分別用pH＝8.0、 6.3、5.9的8mol/L尿素溶液洗滌去雜蛋白后，用pH＝4.5的8mol/L 尿素溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫的目的蛋白，進行SDS-PAGE鑒定；

S6，CP蛋白單克隆抗體制備和病毒中和試驗：對CP蛋白進行單 克隆抗體制備，配制1mg/ml濃度的單克隆抗體溶液；按1:20(克: 毫升)取發(fā)病葉與PBS溶液混合，用勻漿器制成病毒混懸液，3000rpm 離心4-6min，上清即為病毒液，100ml病毒液加入1mg抗體，然后通 過葉片摩擦接毒，觀察發(fā)病情況，確定抗體中和活性；

S7，中和表位分析：將CP蛋白等分成3個區(qū)域，分別是A、B、 C區(qū)，每個區(qū)域約89個aa，將CP蛋白分成兩個多肽，分別是CP-AB 和CP-BC，用大腸桿菌表達，用CP蛋白的單克隆抗體分別與CP-AB 和CP-BC試驗；若與CP-AB反應(yīng)，而不與CP-BC反應(yīng)，說明該抗體識 別的抗原表位位于CP蛋白的A區(qū)；若與CP-AB和CP-BC都反應(yīng)，說 明該抗體識別的抗原表位位于CP蛋白的B區(qū)；若與CP-AB不反應(yīng)， 而與CP-BC反應(yīng)，說明該抗體識別的抗原表位位于CP蛋白的C區(qū)。 這樣，分別將10株單克隆抗體所識別的抗原表位定位在3個不同的 區(qū)域內(nèi)，在確定抗原表位定位到具體的分區(qū)后，將該分區(qū)分成相互重 疊多肽，每個多肽有16個氨基酸殘基，相鄰多肽之間有8個氨基酸 殘基的重疊，通過ELISA分析，將抗原表位定位在16個氨基酸殘基 之內(nèi)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種馬鈴薯Y病毒屬病毒中和表位鑒 定方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述S7中，將CP蛋白等分成3個區(qū) 域，分別是A、B、C區(qū)，每個區(qū)域約89個氨基酸，將CP蛋白分成兩 個多肽，分別是CP-AB和CP-BC，用大腸桿菌表達，用具有中和活性 的CP蛋白的單克隆抗體分別與CP-AB和CP-BC試驗；若與CP-AB反 應(yīng)，而不與CP-BC反應(yīng)，說明該抗體識別的抗原表位位于CP蛋白的 A區(qū)；若與CP-AB和CP-BC都反應(yīng)，說明該抗體識別的抗原表位位于 CP蛋白的B區(qū)；若與CP-AB不反應(yīng)，而與CP-BC反應(yīng)，說明該抗體 識別的抗原表位位于CP蛋白的C區(qū)。這樣，分別將10株單克隆抗體 所識別的抗原表位定位在3個不同的區(qū)域內(nèi)，在確定抗原表位定位到 具體的分區(qū)后，將該分區(qū)分成相互重疊多肽，每個多肽有16個氨基 酸殘基，相鄰多肽之間有8個氨基酸殘基的重疊，通過ELISA分析， 將抗原表位定位在16個氨基酸殘基之內(nèi)。