[發明專利]一種測定黃曲霉毒素B1的信號放大核酸適配體傳感器及其制備方法

在審

• 申請號: 201610069597.4
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105567836A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 王紅旗;劉繼紅;張迪;尹海燕;俎建英;孫江南;祁玉峰;張玲
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 鄭園;張真真

技術領域

本發明屬于農產品質量安全檢測技術領域，具體涉及一種測定黃曲霉毒素B₁的信號放大 核酸適配體傳感器及其制備方法。

背景技術

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是谷物、花生、玉米、油籽等多種糧食和飼料中常見的真菌 毒素污染物，已經成為影響食品安全、危害人類和動物健康的巨型殺手。黃曲霉毒素是一類 由黃曲霉和寄生曲霉產生的二氫呋喃香豆素的衍生物，目前已經發現的有AFB₁、AFB₂、AFG₁、 AFG₂、AFM₁和AFM₂等18種，具有誘導突變、抑制免疫和致癌作用，被世界衛生組織的癌 癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物質。天然食物中以AFB₁最為多見，其危害性也最強。AFB₁的 毒性要比嘔吐毒素的毒性強30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性強20倍；AFB₁的急性毒性是氰化 鉀的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可誘發癌變，致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍，比二甲 基偶氨苯高900倍，人的原發性肝癌也很可能與黃曲霉毒素有關。因此，目前世界上很多國 家已經對食品和飼料中的AF含量提出了嚴格的限量標準，其中尤以歐盟提出的標準最為苛 刻，規定AFB₁含量不得超過2ppb，總AF含量不得超過4ppb。AFB₁的快速、靈敏、準確 分析對于減少AF對人類生命安全的危害、保證國際進出口貿易的暢通具有極其重要的作用。 目前AFB₁的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、酶聯免疫法(ELISA) 等。這些方法雖取得了較大進展，但仍然存在操作要求高、步驟過于繁瑣、靈敏度較差、誤 檢率高、儀器昂貴等不同缺陷。

核酸適配體是一段單鏈寡核苷酸(20～60堿基)，通過折疊能夠形成特有的三維結構， 從而與靶分子高親和力、高特異性結合。與抗體相比，核酸適配體的優點在于：特異性高、 容易進行化學合成、改造與標記、生物化學穩定性好，能可逆地進行變性與復性，還能充分 利用工具酶進行擴增、剪切等后續信號放大處理。各種基于核酸適配體的分析、檢測方法與 技術已呈現出快速、靈敏、方便、低成本等優點，在生物醫學應用中已經顯示出廣闊的應用 前景，但在真菌毒素檢測方面的應用卻相對較少。

電化學生物傳感檢測方法具有快速、靈敏、儀器設備簡單等特殊優勢。近年來國內外研 究者對AFB₁的電化學生物傳感器的構建進行了多方面的努力和嘗試，分別研究了以抗體、 DNA和酶作為識別元素的電化學生物傳感器，并將納米技術、離子液體、導電聚合物等技術 應用于AFB₁的分析中，極大地豐富了電化學生物傳感器和真菌毒素分析的研究內容和思路。

所以，本發明利用新型分子識別元件——核酸適配體的高特異性特點，結合核酸外切酶 循環酶切的信號放大功能，同時利用電化學簡單快捷、高靈敏的優點，構建了一種測定黃曲 霉毒素B₁的信號放大核酸適配體傳感器。

發明內容

為了解決目前AFB₁檢測成本高、假陽性率高、檢測時間過長的缺點，本發明提供了測定 AFB₁的信號放大核酸適配體傳感器，采用AFB₁核酸酸適配體作為分子識別元件，絲網印刷 電極作為換能器，核酸外切酶作為信號放大工具。在本發明中，AFB₁的出現能夠引發核酸外 切酶的酶切循環放大反應，產生較強的電化學信號放大效果。

一種測定黃曲霉毒素B₁的信號放大核酸適配體傳感器，巰基修飾探針通過金-硫鍵結合到 絲網印刷電極的金電極上，AFB₁核酸適配體通過結合到電極表面的巰基修飾探針雜交，組裝 到電極上，核酸外切酶在電極表面參與反應。

所述巰基修飾探針為3’端修飾有巰基，5’端修飾有二茂鐵的巰基探針，其序列如SEQID NO：1所示；AFB₁核酸適配體序列如SEQIDNO：2所示。

一種測定黃曲霉B₁的信號放大核酸適配體傳感器的制備方法，制備步驟如下：