[發明專利]檢測多發性骨髓瘤克隆進化的基因探針組合物及試劑盒

有效

• 申請號: 201610068948.X
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105603087B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 邱錄貴;安剛;秦小琪;劉蘭婷;胡林萍;程濤
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（血液學研究所）
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 天津濱?？凭曋R產權代理有限公司 12211
• 代理人: 張會雪

1.一種檢測多發性骨髓瘤克隆進化的基因探針組合物，其特征在于：包括TP53基因探針,Rb1基因探針,CKS1B基因探針,CYLD基因探針和BIRC2基因探針。

2.根據權利要求1所述一種檢測多發性骨髓瘤克隆進化的基因探針組合物，其特征在于：所述的基因探針組合物包括：

TP53基因探針：對應的克隆編號RP11-89D11，UCSC genome browser；

Rb1基因探針：對應的克隆編號RP11-305D15，UCSC genome browser；

CKS1B基因探針：對應的克隆編號RP11-307C12，UCSC genome browser；

CYLD基因探針：對應的克隆編號RP11-327F22，UCSC genome browser；

BIRC2基因探針:對應的克隆編號RP11-864G5，UCSC genome browser。

3.根據權利要求1或2所述一種檢測多發性骨髓瘤克隆進化的基因探針組合物的制備方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

1)、克隆選擇：選擇含有TP53基因的克隆，編號為RP11-89D11，UCSC genome browser；含有Rb1基因的克隆，編號為RP11-305D15，UCSC genome browser；含有CKS1B基因的克隆，編號為RP11-307C12，UCSC genome browser；含有CYLD基因的克隆，編號為RP11-327F22，UCSC genome browser；含有BIRC2基因的克隆，編號為RP11-864G5，UCSC genome browser；

2)、克隆培養和鑒定：按照篩選確定的克隆編號購買BAC克隆，取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液體培養基中，37℃振搖活化培養8-16小時；然后將菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液體培養基中，37℃震搖培養8-16小時；對TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2的BAC克隆用相對應的基因引物進行多聚酶鏈式反應擴增，用1-2％的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析，從而完成待選克隆的分子鑒定；

3)、基因探針的制備和鑒定：獲得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法對酶切后的DNA進行熒光素標記，再對TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2基因探針組合后進行沉淀和濃縮，將制作好的探針組合物溶解到含有50％去離子甲酰胺的雜交緩沖液中，即得熒光標記探針組雜交混合液，采用正常人外周血單個核細胞甩片進行探針鑒定。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：克隆培養和鑒定步驟中使用的引物序列為：

TP53基因探針：上游引物5’-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3’和

下游引物5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’；

Rb1基因探針：上游引物5’-CCTCTCGTCAGGCTTGAGTT-3’和

下游引物5’-ACAGATTCCCCACAGTTCCT-3’；

CKS1B基因探針：上游引物5’-GTGCTGTTGGGAGTTGCTTG-3’和

下游引物5’-TTGGCTATGTCCTTGGGCAG-3’；

CYLD基因探針：上游引物5’-CCCCCTTTCTAGGGTGAGGA-3’和

下游引物5’-TTCAGCAACGTGGTGTCCAT-3’；

BIRC2基因探針：上游引物5’-CAAAGGCATTTGTGCTGGGA-3’和

下游引物5’-CTGCAGTCATTTCAGCGTCG-3’；

多聚酶鏈式反應擴增條件為：94℃5分鐘；“94℃30秒，58-62℃30秒，72℃45秒”循環35次：72℃10分鐘。

5.一種檢測多發性骨髓瘤克隆進化的試劑盒，其特征在于：包括權利要求1或2所述基因探針組合物。

6.根據權利要求5所述一種檢測多發性骨髓瘤克隆進化的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括雜交緩沖液；所述基因探針組合物溶解在雜交緩沖液中，即熒光標記探針組雜交混合液，所述TP53基因探針的濃度為：4ng/μL，Rb1基因探針的濃度為:4ng/μL,CKS1B基因探針的濃度為：4ng/μL，CYLD基因探針的濃度為：4ng/μL，BIRC2基因探針的濃度為：4ng/μL。