[發(fā)明專利]一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方法及應用

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• 申請日: 2016-01-21
• 公開（公告）號: CN105641689A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 錢泓;吳有強;宣春玲;查銀河;賈寶琴;曹珊珊;陳藻
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/085
• 分類號: A61K39/085;A61P31/04;A61P15/14;C07K14/31
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗的制備方法及應用。屬 于生物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺組織受 到微生物感染而引起的一種炎癥，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛 常見病、多發(fā)病，是造成乳制品業(yè)經(jīng)濟損失最為嚴重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物 大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細菌引起的 奶牛乳房炎占總發(fā)病率的90％以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。

當前奶牛乳房炎的治療方法主要是采用抗生素治療，抗生素用于治療奶牛乳房炎 已有50多年的歷史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長期單一的、大劑 量的不科學使用抗生素，引起了敏感性細菌的消除，耐藥性細菌逐漸占了主流，尤其是金黃 色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴重，導致了抗生素治療收效甚微。

用疫苗來防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預防奶牛感染病原菌 而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三， 使用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題；最后是操作簡便，費用低廉。當前， 研制成功的疫苗很少，且大都數(shù)為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產(chǎn)實踐中，對乳房炎的防治 有一定作用，然而隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力 返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、免疫期短等不足，為提高傳統(tǒng)疫苗的安全 性與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極其重要。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱SA)，也稱“金葡菌”，是一種革蘭氏 染色陽性的球菌，直徑0.8μm，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，并可以產(chǎn)生金黃色的色素，并 因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的 產(chǎn)量和質(zhì)量，給奶制品產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。有研究表明，金黃色葡萄球菌分泌的β溶 血素是導致奶牛乳房炎的一個致病因子。

金葡菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。β溶血素(亦稱β-toxin)就是其毒素之一，它具有白 細胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為37～39 kDa，其等電點(pI)高于9。β溶血素是一種鎂依賴神經(jīng)酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸膽堿，β溶血素依靠這種酶活性，水解組成細胞膜的磷脂 雙分子層，從而破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解，引起溶血。將β溶血素進行定點突變 后，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫 動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方法 及應用。重組蛋白與合適佐劑混合制備的亞單位疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進 細胞免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產(chǎn)生很好的交叉保護反應，是一種更加安 全穩(wěn)定、制備簡單、應用方便、價格低廉的新型疫苗。

所述的重組β-溶血素蛋白來自金黃色葡萄球菌，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本發(fā)明還提供一種奶牛金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗的制備方法，主要包 括以下步驟：1)定點突變金黃色葡萄球菌β-溶血素蛋白基因；2)將定點突變的β-溶血素蛋 白基因克隆到pET28a載體中；3)將步驟2)獲得的表達載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，誘導 表達獲得重組β-溶血素蛋白；4)使用鎳柱親和層析純化步驟3)得到的重組β-溶血素蛋白； 5)將純化得到的重組β-溶血素蛋白與藥學上可接受的佐劑(如ISA206VG佐劑)充分混勻 后得到奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎重組亞單位疫苗。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下：奶牛乳房炎亞單位疫苗即利用 致病菌主要的保護性免疫原制成不含有核酸、能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體的疫苗，將其直接注入機 體而激活免疫系統(tǒng)，以達到預防和治療疾病的目的。重組蛋白與合適佐劑混合制備的亞單位 疫苗與致病菌的自然感染過程相似，可促進細胞免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答， 產(chǎn)生很好的交叉保護反應，是一種更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應用方便、價格低廉，且省時 省力具有顯著療效的新型疫苗。

附圖說明