[發(fā)明專利]穿膜肽TAT2在轉(zhuǎn)基因棉花培育中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610068076.7
• 申請(qǐng)日: 2016-02-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105567729A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝福順;孫立榮;李金侗;張高峰;苗琛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時(shí)立新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及穿膜肽TAT2在轉(zhuǎn)基因棉花培育中的應(yīng) 用。

背景技術(shù)

棉花是當(dāng)今世界最重要的天然紡織纖維原料，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和戰(zhàn)略儲(chǔ) 備。中國(guó)不僅是紡織品出口和生產(chǎn)大國(guó)，也是紡織品消費(fèi)大國(guó)。然而，中國(guó)棉花生產(chǎn)由于受 耕地面積減少、糧食安全和糧棉比價(jià)等因素影響，種植面積不可能大幅度增長(zhǎng)，棉花增產(chǎn)增 效的唯一途徑是加強(qiáng)科技創(chuàng)新，提高棉花生產(chǎn)的科技水平和單產(chǎn)水平。除耕地因素外，干 旱、鹽堿、病害、蟲害等生物及非生物因素也顯著影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。

傳統(tǒng)棉花品種選育受種質(zhì)資源限制，而且周期長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因手段能夠有效克服上述 限制，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將調(diào)控產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性的基因引入棉花中，可培育出產(chǎn)量、品質(zhì) 和抗逆性優(yōu)良的棉花新品種。棉花轉(zhuǎn)基因應(yīng)用不受食品安全限制，上世紀(jì)我國(guó)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因 抗蟲棉為防治棉鈴蟲做出了重大貢獻(xiàn)。

棉花轉(zhuǎn)基因手段主要分三種，即農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法。農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法需建立棉花組織培養(yǎng)體系、轉(zhuǎn)基因效率嚴(yán)格受到受體基因型限制。基因槍法需要價(jià) 格高的基因槍，而且轉(zhuǎn)化率低。花粉管通道法無(wú)需組織培養(yǎng)、不受受體基因型限制、無(wú)需昂 貴的儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)便、可以大規(guī)模進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目前被廣泛使用。花粉管通道技術(shù)的 主要限制因素是轉(zhuǎn)化效率偏低。

穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPPs）是一種具有細(xì)胞穿透功能的小分子 多肽。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，穿膜肽可幫助具有治療功效的蛋白多肽等大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞從而 提高治療效果。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CPPs可以有效攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性疏水大 分子進(jìn)入細(xì)胞，且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。根據(jù)其氨基酸組成，可分為陽(yáng)離子CPPs和兩性CPPs。.

在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中，穿膜肽已經(jīng)在多種植物中證明對(duì)基因有攜帶作用。Unamalai等 利用CPPs將小分子siRNA導(dǎo)入煙草懸浮細(xì)胞（Unnamalaietal.,Cationic oligopeptide-mediateddeliveryofdsRNAforpost-transcriptionalgene silencinginplantcells,FEBSLetters,2004,566(1):307-310）。M?e等將熒光素 成功導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體（M?eetal.,Internalisationofcell-penetratingpeptides intotobaccoprotoplasts,BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes, 2005,1669(2):101-107）。GUS蛋白和編碼鈣蛋白的7.2kb線性質(zhì)粒DNA均能通過(guò)與CPPs 混合導(dǎo)入小黑麥（Chughetal.,Translocationofcell-penetratingpeptidesand deliveryoftheircargoesintriticalemicrospores,PlantCellReports,2009, 28(5):801-810）。FDA標(biāo)記的CPPs被成功導(dǎo)入煙草懸浮細(xì)胞（Chughetal.,Cellular uptakeofcell-penetratingpeptidespVECandtransportaninplants,Journal ofPeptideScience,2008,14(4):477-481）。也有研究利用CPPs將抗旱基因通過(guò)花粉 管通道法轉(zhuǎn)入玉米（韓猛,線性DNA結(jié)合細(xì)胞穿膜肽的花粉管通道法將AtCKX3導(dǎo)入玉米自 交系的研究,學(xué)位論文,長(zhǎng)江大學(xué),2015）。但尚未見(jiàn)將CPPs用于轉(zhuǎn)基因棉花培育的相關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要目的是提供穿膜肽TAT2在培育棉花轉(zhuǎn)基因新品種中的新應(yīng)用途徑，同 時(shí)提供一種由穿膜肽TAT2介導(dǎo)的棉花花粉管通道轉(zhuǎn)基因新方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

穿膜肽TAT2在轉(zhuǎn)基因棉花培育中的應(yīng)用，用于攜帶擬轉(zhuǎn)化DNA片段進(jìn)入棉花基因組；所 述穿膜肽TAT2，包括18個(gè)氨基酸，序列如SEQIDNO.1所示，具體為：

Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg；

即RKKRRQRRRRKKRRQRRR；