[發明專利]一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG、制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201610066098.X
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105647955A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 牛秋紅;張林;惠豐立;柯濤;董冰雪;韓雪梅
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG、 制備方法及其應用。

背景技術

芽孢桿菌在自然界中多樣性豐富、分布廣，具有耐高溫高壓、抗逆性強、 易儲存等生物特性，廣泛應用于農業、工業、食品、飼料和醫藥等行業。芽胞 桿菌能夠產生很多重要的生物活性物質，還可以抑制多種植物病原菌；利用芽 胞桿菌制成的微生態飼料添加劑具有增加飼料利用率、提高動物生產性能、促 進機體免疫、促進動物胃腸道微生態平衡及抗菌防病等功效。鑒于芽孢桿菌的 重要性以及分子克隆技術的日漸成熟，若能夠對芽孢桿菌進行熒光標記，實現 實時跟蹤，將對芽孢桿菌研究到分子水平，可以加深對芽孢桿菌分子作用機理 的認識。

現有技術中，常用的方法是針對特定的芽孢桿菌，選擇其中特定的看家基 因，比如細胞形態維持蛋白基因mreB，然后在看家基因的碳末端融合表達綠色 熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)，實現gfp組成型表達菌株。然而， 由于不同的芽孢桿菌基因存在特異性，每換一種菌株都得重新構建質粒，缺乏 質粒應用的廣泛性，增加了構建能夠穩定且高水平表達gfp的芽孢桿菌菌株的難 度。

綜上，現有技術中存在的問題是，現有的應用于芽孢桿菌的表達gfp的質粒 缺乏廣泛性、通用性。

發明內容

本發明實施例的目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG、制備方法 及其應用，用以解決現有的應用于芽孢桿菌的表達gfp的質粒缺乏廣泛性、通用 性的問題。

本發明的第一個目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG，其堿基序 列如SEQIDNO.1所示，所述穿梭質粒pPG具有gfp序列。

優選的，所述穿梭質粒pPG以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)菌 株、質粒pSG1170、芽孢桿菌表達載體pHY300PLK為原料制備而成。

本發明的第二個目的是提供一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG的制備方 法，包括以下步驟：

步驟1，獲得啟動子Pxyl序列、gfp序列和終止子terminator序列，包括：

提取芽孢桿菌的基因組DNA，并以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板， 以Pxyl-F和Pxyl-R為引物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖 電泳，最后膠回收，獲得上游帶BamHI酶切位點的啟動子Pxyl序列，其堿基序 列如SEQIDNO.4所示，所述Pxyl-F的堿基序列如SEQIDNO.2所示，所述 Pxyl-R的堿基序列如SEQIDNO.3所示；

購買含gfp序列的質粒pSG1170，并以質粒pSG1170為模板，以Gfp-F和 Gfp-R為引物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠 回收，獲得gfp序列，其堿基序列如SEQIDNO.7所示，所述Gfp-F的堿基序列 如SEQIDNO.5所示，所述Gfp-R的堿基序列如SEQIDNO.6所示；

以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以Teminator-F和Teminator-R為引 物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得 下游帶XbaI酶切位點的終止子terminator序列，其堿基序列如SEQIDNO.10 所示，所述Teminator-F的堿基序列如SEQIDNO.8所示，所述Teminator-R的 堿基序列如SEQIDNO.9所示；

步驟2，構建Pxyl-gfp序列，包括：

步驟2.1，將步驟1中獲得的啟動子Pxyl序列和gfp序列分別用XhoI單酶 切，然后將單酶切產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得啟動子Pxyl序列的 XhoI單酶切產物和gfp序列的XhoI單酶切產物；

步驟2.2，將步驟2.1中獲得的啟動子Pxyl序列的XhoI單酶切產物和gfp 序列的XhoI單酶切產物經T4DNA連接酶連接，然后經瓊脂糖電泳回收，獲得 連接產物；

步驟2.3，以步驟2.2獲得的連接產物為模板，以Pxyl-F和Gfp-R為引物， 進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得Pxyl-gfp 序列；

步驟3，構建Pxyl-gfp-teminator模塊序列