[發明專利]一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG、制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201610066098.X
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105647955A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 牛秋紅;張林;惠豐立;柯濤;董冰雪;韓雪梅
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于芽孢桿菌的穿梭質粒pPG，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO.1所示，所述穿梭質粒pPG具有gfp序列。

2.根據權利要求1所述的穿梭質粒pPG，其特征在于，所述穿梭質粒pPG 以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)菌株、質粒pSG1170、芽孢桿菌表達 載體pHY300PLK為原料制備而成。

3.一種權利要求1所述的穿梭質粒pPG的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟：

步驟1，獲得啟動子Pxyl序列、gfp序列和終止子terminator序列，包括：

提取芽孢桿菌的基因組DNA，并以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板， 以Pxyl-F和Pxyl-R為引物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖 電泳，最后膠回收，獲得上游帶BamHI酶切位點的啟動子Pxyl序列，其堿基序 列如SEQIDNO.4所示，所述Pxyl-F的堿基序列如SEQIDNO.2所示，所述 Pxyl-R的堿基序列如SEQIDNO.3所示；

購買含gfp序列的質粒pSG1170，并以質粒pSG1170為模板，以Gfp-F和 Gfp-R為引物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠 回收，獲得gfp序列，其堿基序列如SEQIDNO.7所示，所述Gfp-F的堿基序列 如SEQIDNO.5所示，所述Gfp-R的堿基序列如SEQIDNO.6所示；

以所述芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以Teminator-F和Teminator-R為引 物，進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得 下游帶XbaI酶切位點的終止子terminator序列，其堿基序列如SEQIDNO.10 所示，所述Teminator-F的堿基序列如SEQIDNO.8所示，所述Teminator-R的 堿基序列如SEQIDNO.9所示；

步驟2，構建Pxyl-gfp序列，包括，

步驟2.1，將步驟1中獲得的啟動子Pxyl序列和gfp序列分別用XhoI單酶 切，然后將單酶切產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得啟動子Pxyl序列的 XhoI單酶切產物和gfp序列的XhoI單酶切產物；

步驟2.2，將步驟2.1中獲得的啟動子Pxyl序列的XhoI單酶切產物和gfp 序列的XhoI單酶切產物經T4DNA連接酶連接，然后經瓊脂糖電泳回收，獲得 連接產物；

步驟2.3，以步驟2.2獲得的連接產物為模板，以Pxyl-F和Gfp-R為引物， 進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得Pxyl-gfp 序列；

步驟3，構建Pxyl-gfp-teminator模塊序列

步驟3.1，將步驟2.3中獲得的Pxyl-gfp序列和步驟1中獲得的終止子 terminator序列分別用BglII單酶切，然后將單酶切產物進行瓊脂糖電泳，最后 膠回收，獲得Pxyl-gfp序列的BglII單酶切產物和終止子terminator序列的BglII 單酶切產物；

步驟3.2，將Pxyl-gfp序列的BglII單酶切產物和終止子terminator序列的 BglII單酶切產物經T4DNA連接酶連接，然后經瓊脂糖電泳回收，獲得連接產 物；

步驟3.3，以步驟3.2獲得的連接產物為模板，以Pxyl-F和Teminator-R為 引物，進行PCR擴增，并將PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳后膠回收，獲得 Pxyl-gfp-teminator模塊序列；

步驟4，構建穿梭質粒pPG

步驟4.1，分別將芽孢桿菌表達載體pHY300PLK和步驟3.3獲得的 Pxyl-gfp-terminator模塊序列經BamHI和XbaI雙酶切，然后將雙酶切產物進行 瓊脂糖電泳，最后膠回收，獲得芽孢桿菌表達載體pHY300PLK的雙酶切產物和 Pxyl-gfp-terminator模塊序列的雙酶切產物；

步驟4.2，將步驟4.1獲得的芽孢桿菌表達載體pHY300PLK的雙酶切產物 和Pxyl-gfp-terminator模塊序列的雙酶切產物經T4DNA連接酶連接，然后經瓊 脂糖電泳回收，獲得穿梭質粒pPG。