[發(fā)明專利]一種含有DNA片段和有機染料的檢測溶液及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105717081A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏輝;程翰俊
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，具體涉及一種含有DNA片段和有機染料的檢測溶液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

K⁺是生物體內(nèi)豐度第二高的金屬離子，參與生物體內(nèi)一系列的生化反應(yīng)，特別在信號傳導(dǎo)方面，K⁺參與激活/調(diào)節(jié)大量的信號傳導(dǎo)通路。人體內(nèi)K⁺濃度失衡會導(dǎo)致一系列的疾病，包括心血管疾病，腎功能失調(diào)，神經(jīng)功能紊亂以及其它疾病。此外，腫瘤細(xì)胞表面的K⁺通道也是某些抗腫瘤藥物的靶點。因此，實現(xiàn)生物體內(nèi)K⁺的簡便、實時、高靈敏高選擇性分析對于從分子水平探索某些生理病理過程、信號傳導(dǎo)過程以及某些疾病的發(fā)病機制有著極為重要的意義。傳統(tǒng)檢測K⁺的方法主要有離子選擇性電極(ion-selectiveelectrode,ISE)、等離子耦合原子吸收光譜法(inductivecoupledplasmaatomicabsorptionspectrophotometry,ICP-AAS)、離子色譜法等。然而這些經(jīng)典方法在檢測生物體內(nèi)K⁺存在許多不足之處。首先，這些方法大多需要昂貴而復(fù)雜的儀器，需要專業(yè)化的儀器操作員進(jìn)行操作，因此難以實現(xiàn)現(xiàn)場分析。其次，生物樣品需要復(fù)雜的前處理、預(yù)富集和分離等步驟，分析時間長，無法實現(xiàn)生物樣品中K⁺的快速分析，時間分辨率也較差。與其他方法相比，K⁺離子選擇性電極雖然相對較為簡單，但是需要樣品量較大，因此在生物樣品分析領(lǐng)域同樣有著很大的局限性。

因此，十分需要發(fā)展一種新型的檢測技術(shù)用于生物體內(nèi)K⁺的高靈敏、高選擇性檢測。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明針對目前生物體內(nèi)K⁺檢測方法存在的操作復(fù)雜、耗時長、時間分辨率較差等現(xiàn)狀，通過發(fā)展新型DNA技術(shù)對K⁺進(jìn)行高選擇性、高靈敏性的檢測。該技術(shù)用于K⁺檢測具有以下優(yōu)點：1)該檢測方法對K⁺有著良好的靈敏度和監(jiān)測限，完全滿足生物體內(nèi)K⁺的檢測要求；2)選擇性好，生物體內(nèi)其他物質(zhì)沒有干擾；3)成本低廉，無需特意設(shè)計和合成對K⁺有選擇性響應(yīng)的熒光探針分子；4)需樣量很小，檢測操作簡便，分析速度較快，可以實現(xiàn)生理病理過程中生物體內(nèi)K⁺的動態(tài)觀測。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種DNA技術(shù)用于高靈敏高選擇性快速檢測生物體內(nèi)K⁺。該方法包含一條富含鳥嘌呤(G堿基)的單鏈DNA以及可以與該DNA相互作用的熒光染料。該DNA在Na⁺存在下形成反平行的四鏈體結(jié)構(gòu)，該染料與其相互作用之后，熒光性質(zhì)基本不發(fā)生變化。一旦加入K⁺，該DNA優(yōu)先與K⁺相互作用形成正平行結(jié)構(gòu)的四鏈體，其與所選染料相互作用之后可以顯著增強有機染料的熒光。

本發(fā)明提供了一種含有DNA片段和有機染料的檢測溶液，該檢測溶液中包括有富含鳥嘌呤的單鏈DNA片段，鈉離子和作為信號輸出分子的有機小分子染料。

該單鏈DNA片段在單獨含有Na⁺的溶液中形成反平行的DNA四鏈體結(jié)構(gòu)。

在該單鏈DNA片段的Na⁺溶液中加入K⁺，則其由反平行的DNA四鏈體結(jié)構(gòu)變成正平行的DNA四鏈體結(jié)構(gòu)。由于所選用的DNA富含G堿基，其可以在Na⁺存在下形成反平行的四鏈體結(jié)構(gòu)；加入K⁺后該DNA優(yōu)先與K⁺相互作用，從而從反平行結(jié)構(gòu)的四鏈體轉(zhuǎn)變成正平行結(jié)構(gòu)的四鏈體。所選取的有機熒光染料與反平行的DNA四鏈體相互作用，熒光基本沒有變化；與正平行的DNA四鏈體相互作用，其熒光發(fā)生顯著改變。

所述單鏈DNA片段的堿基序列為5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’。

一種基于DNA技術(shù)的生物體內(nèi)K⁺的檢測方法，包括以下步驟：

1)特定序列DNA制備：利用固相合成技術(shù)制備所設(shè)計的單鏈DNA片段，經(jīng)分離純化后得到所述的特定序列的單鏈DNA片段；

2)配制DNA儲備液：配制適合pH值及化學(xué)組分的緩沖溶液即TE緩沖液待用；取一定量步驟1)中的單鏈DNA片段溶于該緩沖液中得到DNA儲備液；