[發(fā)明專利]一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細(xì)胞模型及其用途和使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610064454.4
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105695486A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚銳;顧健
• 申請（專利權(quán)）人: 西南交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/65;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68
• 代理公司: 成都華風(fēng)專利事務(wù)所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細(xì)胞模型，屬于醫(yī)藥生 物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

慢性缺氧病變，如慢性阻塞性肺疾病，是一種具有氣流受限特征的疾病，與肺部對 香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)及慢性缺氧有關(guān)。隨著病程的進(jìn)展，長期慢 性炎癥及缺氧會引發(fā)缺氧性肺血管收縮，肺血管內(nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重構(gòu)等最終導(dǎo)致肺動(dòng) 脈高壓的發(fā)生，肺血管重構(gòu)與病程進(jìn)展及其并發(fā)肺動(dòng)脈高壓密切相關(guān)。病理變化過程主要涉 及機(jī)體細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)氧變化，相關(guān)的功能基因則為缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia induciblefactor-1ɑ,HIF-1ɑ)。

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，基于檢測報(bào)告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大的 發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，其涉及完整細(xì)胞，在活細(xì)胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影響， 更接近體內(nèi)的生化過程，可以較為準(zhǔn)確地了解藥物的生物學(xué)特性。

構(gòu)建抗慢性缺氧病變活性的快速、分類篩選模型不僅有助于從中藥或已有的化學(xué)藥 或這新化學(xué)實(shí)體中尋找和發(fā)現(xiàn)治療神經(jīng)纖維性病變的有效藥物，為新藥研發(fā)提供新的先導(dǎo)化 合物，也可為各種藥物治療神經(jīng)纖維性病變的作用機(jī)制研究提供一定的前期基礎(chǔ)，有利于中 醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

盧瓊報(bào)道了基于HIF-1ɑ啟動(dòng)子構(gòu)建的藥物篩選模型，但并沒有公開所用的基因片段 的堿基序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員無從知曉此篩選模型的具體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法(盧瓊，腦缺血藥 物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建及應(yīng)用研究，西南交通大學(xué)學(xué)位論文，2014年)。

發(fā)明內(nèi)容

為了構(gòu)建一種具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的篩選模型，本發(fā)明提供了一種基因 構(gòu)建物。

本發(fā)明提供的基因構(gòu)建物從5’端到3’端依次含有：HIF-1ɑ啟動(dòng)子基因-583bp～ +23bp序列和報(bào)告基因序列。

以大鼠為例，HIF-1ɑ啟動(dòng)子基因-583bp～+23bp序列詳見SEQNO.1：

進(jìn)一步地，上述報(bào)告基因選自：熒光蛋白基因和/或熒光素酶基因。

優(yōu)選地，上述熒光蛋白基因?yàn)榫G色熒光蛋白(GFP)基因或紅色熒光蛋白(RFP)基 因；上述熒光素酶基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。

紅色熒光蛋白中E2-Crimson較為常用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種重組載體，此載體含有上述的基因構(gòu)建物。

本發(fā)明中的載體指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受 體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子，常用的有質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。

本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了一種穩(wěn)定的細(xì)胞，此細(xì)胞含有上述的重組載體或其基因組中整 合上述的基因構(gòu)建物。

進(jìn)一步地，此細(xì)胞選自HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞或干細(xì)胞中的任一種。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了構(gòu)建上述重組載體的方法，它包括如下步驟：

(1)合成HIF-1ɑ啟動(dòng)子基因-583bp～+23bp序列；

(2)將步驟(1)合成的序列與帶有報(bào)告基因的報(bào)告載體分別進(jìn)行酶切，連接報(bào)告載體與啟 動(dòng)子片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即得重組載體。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述報(bào)告載體為帶有報(bào)告基因的pSC基礎(chǔ)質(zhì)粒。

此處所述的報(bào)告基因同上述，即選自熒光蛋白基因和/或熒光素酶基因。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了構(gòu)建上述的穩(wěn)定的細(xì)胞的方法，即將述的重組載體轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞或干細(xì)胞中的任一種。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了此穩(wěn)定的細(xì)胞的用途，此穩(wěn)定的可用于篩選可提高HIF-1ɑ表達(dá) 水平或具有抗慢性缺氧病變活性的藥物，如各類中藥、現(xiàn)有的化學(xué)藥、新化學(xué)實(shí)體等等。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的方法，此方法包括 如下步驟：

(1)將候選藥物給予本發(fā)明構(gòu)建的穩(wěn)定的細(xì)胞；

(2)檢測所述細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)情況；

(3)判斷結(jié)果，若所述候選藥物能提高報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選藥物可提高HIF-1ɑ 表達(dá)水平或具有抗慢性缺氧病變活性。

進(jìn)一步地，

步驟(1)包括將候選藥物加入上述構(gòu)建的穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)；