[發(fā)明專利]一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細胞模型及其用途和使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610064454.4
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105695486A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚銳;顧健
• 申請（專利權(quán)）人: 西南交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/65;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/68
• 代理公司: 成都華風(fēng)專利事務(wù)所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

1.一種基因構(gòu)建物，其特征在于：所述基因構(gòu)建物從5’端到3’端依次含有：HIF-1ɑ啟動子基因-583bp～+23bp序列和報告基因序列。

2.如權(quán)利要求1所述的基因構(gòu)建物，其特征在于：所述報告基因選自：熒光蛋白基因和/或熒光素酶基因；進一步地，所述熒光蛋白基因為綠色熒光蛋白基因或紅色熒光蛋白基因，所述熒光素酶基因為螢火蟲熒光素酶基因。

3.一種重組載體，其特征在于：所述的重組載體含有權(quán)利要求1或2任一項所述的基因構(gòu)建物。

4.一種穩(wěn)定的細胞，其特征在于：所述的細胞含有權(quán)利要求3所述的重組載體或其基因組中整合有權(quán)利要求1或2任一項所述的基因構(gòu)建物。

5.如權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的細胞，其特征在于：所述的細胞選自HEK293細胞、Hela細胞、CHO細胞或干細胞中的任一種。

6.構(gòu)建權(quán)利要求3所述重組載體的方法，其特征在于：它包括如下步驟：

（1）合成HIF-1ɑ啟動子基因-583bp～+23bp序列；

（2）將步驟（1）合成的序列與帶有報告基因的報告載體分別進行酶切，連接報告載體與啟動子片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即得重組載體；

進一步地，步驟（2）中，所述報告載體為帶有報告基因的pSC基礎(chǔ)質(zhì)粒。

7.構(gòu)建權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的細胞的方法，其特征在于：將權(quán)利要求3所述的重組載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞、Hela細胞、CHO細胞或干細胞中的任一種。

8.權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的細胞的用途，其特征在于：所述的細胞用于篩選可提高HIF-1ɑ表達水平或具有抗慢性缺氧病變活性的藥物。

9.一種篩選可提高HIF-1ɑ表達水平或具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）將候選藥物給予權(quán)利要求4或5所述的穩(wěn)定的細胞；

（2）檢測所述細胞中報告基因的表達情況；

（3）判斷結(jié)果，若所述候選藥物能提高報告基因的表達，則表明該候選藥物可提高HIF-1ɑ表達水平或具有抗慢性缺氧病變活性；

進一步地，步驟（1）包括將候選藥物加入權(quán)利要求4或5所述的穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)；

步驟（2）包括檢測實驗組的報告基因的表達，并與空白對照組比較，所述空白對照組是不添加所述候選藥物的與實驗組相同條件培養(yǎng)的權(quán)利要求4或5所述的細胞；

若實驗組中報告基因的表達水平高于對照組，表明候選藥物可提高HIF-1ɑ表達水平或抗慢性缺氧病變活性。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：實驗組的報告基因的表達水平/對照組的報告基因的表達水平≥150%，表明候選藥物可提高HIF-1ɑ表達水平或具有抗慢性缺氧病變活性。