[發明專利]芽胞桿菌生物被膜形成能力評估方法及應用的培養基

有效

• 申請號: 201610064177.7
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105543325B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 喻國輝;李一平;沈漢國;劉文;陳繼敏;劉蘭
• 申請（專利權）人: 珠海市現代農業發展中心
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/07;C12R1/125;C12R1/01
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

本發明提供了一種快速便捷評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基組合，包括第一液體培養基和第二液體培養基，利用第一液體培養基和第二液體培養基的差異性來篩選生物被膜促進物質，同時還可以評估不同濃度的待測物質促進生物被膜形成能力的效果。

技術領域

本發明涉及芽胞桿菌生物被膜形成能力評估領域，具體地說是涉及評估和研究芽胞桿菌是否具有生物被膜形成能力以及形成能力強弱的方法及所應用的培養基，為篩選促進生物被膜形成能力的物質以及進一步開發這一類型的芽胞桿菌用于生物農藥和生物肥料提供支持。

背景技術

生物被膜(biofilm)指細胞通過胞外基質緊密結合在一起形成的群體。生物被膜為細菌提供保護，使細菌防御各種環境因子及其組合、形形色色的抗生素、捕食者和人類的免疫系統。

芽胞桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環境中的革蘭氏陽性細菌，可以產生內生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同時還是植物體內常見的一種內生菌，對人畜無害，不污染環境。它生長速度快、營養需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖和與繁殖，而且生產芽胞桿菌制劑的工藝簡單，制劑穩定，施用方便，存儲期長，是一種理想的生防微生物。由于自然界獲得的芽胞桿菌還需要在實驗室開展進一步的評估，其中用于土傳病害治理的芽胞桿菌要想發揮良好的防效，還需要具備良好的土壤和植物根際定殖能力。而芽胞桿菌能在土壤和植物根際良好定殖的關鍵是其生物被膜形成能力的強弱，因此評估芽胞桿菌類生防菌株生物被膜形成能力的強弱對于進一步開發芽胞桿菌用于生物農藥或生物肥料的產業化開發具有重要意義。此外，一些針對土傳病害的生物農藥，由于施用時需要接種到土壤中，待其萌發并在土壤中定殖才能進一步發揮作用，而土壤環境條件復雜，不合適的土壤理化因素如pH、鹽度、營養源以及微生物因素如病原菌分泌毒素的存在等，都會影響到芽胞的萌發并最終發揮效果。篩選和尋找促進芽胞桿菌在土壤和植物根際快速形成生物被膜的物質，有助于提高這一類生物農藥或生物制劑的田間應用效果及其穩定性。

在革蘭氏陽性細菌中，枯草芽胞桿菌的生物被膜形成研究成為模式和典范。枯草芽胞桿菌最著名的特點是在饑餓和高種群密度時形成感受態和芽胞，除此之外，還發現許多枯草芽胞桿菌能夠在固體平板上形成復雜具褶皺的菌落，并在液體表面形成薄皮，這種在固體表面或液體表面形成的結構即生物被膜。枯草芽胞桿菌生物被膜形成及其基因調控得到了深入的研究。

目前被深入研究生物被膜形成機制的枯草芽胞桿菌菌株為NCIB3610菌株。枯草芽胞桿菌生物被膜的形成涉及到多種轉錄調控因子，其中最核心的轉錄調控因子是SinR、SinI和兩種新鑒定的蛋白，YlbF和YmcA。轉錄調控因子SinR是控制枯草芽胞桿菌生物被膜形成轉換的主調控因子。SinR在枯草芽胞桿菌細胞中組成型表達，并在運動的細胞中抑制控制基質產生基因的轉錄，間接促進細胞之間保持分開和運動。當條件有利于生物被膜形成時，SinR的活性受到拮抗。SinI和兩種新鑒定的蛋白(YlbF和YmcA)，直接和/或間接拮抗SinR的活性，SinR活性降低后導致細胞的運動能力喪失，細胞之間形成鏈狀并開始分泌胞外基質，并最終形成穩定的具有三維結構的生物被膜。胞外基質由胞外多糖(EPS)和蛋白質TasA組成。

目前在微觀水平對枯草芽胞桿菌生物被膜的研究依賴超薄切片技術和高放大倍數熒光顯微鏡技術。在宏觀水平對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的研究則依賴于枯草芽胞桿菌在不同液培養基表面形成的薄皮或固體培養基表面形成的菌落。目前常用的幾種培養基配方如下：