[發明專利]芽胞桿菌生物被膜形成能力評估方法及應用的培養基

有效

• 申請號: 201610064177.7
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105543325B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 喻國輝;李一平;沈漢國;劉文;陳繼敏;劉蘭
• 申請（專利權）人: 珠海市現代農業發展中心
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/07;C12R1/125;C12R1/01
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

1.一種評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基，其特征在于，所述培養基包括：

第一液體培養基，所述第一液體培養基包含的溶質及濃度為，100mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，1mM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調整pH為7.0；所述第一液體培養基的最終pH為7.0；

第二液體培養基，所述第二液體培養基包含的溶質及濃度為，100mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，1mM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％細菌學蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調整pH為7.0；所述第二液體培養基的最終pH為7.0。

2.根據權利要求1所述一種評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基，其特征在于，在第一液體培養基和第二液體培養基中分別加入1.5％的瓊脂制成第一固體培養基和第二固體培養基。

3.一種應用權利要求1所述的培養基評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

將待測菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養基中，在37℃下以180rpm的速度振蕩培養20小時，使菌液的OD₆₀₀值達到0.8以上；

然后用新鮮的LB培養基稀釋菌液，使菌液的OD₆₀₀達到0.02，用作待測菌種液，要求待測菌種液中芽胞桿菌的濃度達到10⁶CFU/mL以上；

將滅菌后的第一液體培養基和第二液體培養基分別加入無菌平板中，將待測菌種液按照0.08％～0.1％的接種量滴加在2種培養液的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養，分別在12h、24h、 48h、72h觀察薄皮的形成；

如果能夠在第一液體培養基中形成完整的薄皮，但不能在第二液體培養基中形成完整薄皮的菌株，判定為屬于生物被膜形成能力中等菌株；

如果在第一液體培養基和第二液體培養基中僅能形成漂浮的殘缺不全的薄皮，則判定為無生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株；

如果能夠同時在第一液體培養基和第二液體培養基中形成薄皮的，則判定為生物被膜形成能力強的菌株；

在第一液體培養基中越早形成結構穩定薄皮的菌株，則被判定為生物被膜形成能力越強。

4.一種應用權利要求1所述的培養基評估促進芽胞桿菌生物被膜形成能力的物質的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

將選取的芽胞桿菌菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養基中，在37℃下以180rpm的速度振蕩培養，20小時，使菌液的OD₆₀₀值達到0.8以上；

然后用新鮮的LB培養基稀釋菌液，使菌液的OD₆₀₀達到0.02，用作試驗菌種液，要求試驗菌種液中芽胞桿菌的濃度達到10⁶CFU/mL以上；

將滅菌后的第一液體培養基和第二液體培養基分別加入無菌平板中，將試驗菌種液按照0.08％-0.1％的接種量滴加在2種培養基的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養，分別在12h、24h、 48h、72h觀察薄皮的形成；

觀察如果在第一液體培養基上能夠在12h～24h內形成薄皮，但不能在第二液體培養基上在12h～24h內形成薄皮的或超過72h僅在第二液體培養基上形成破碎的不完整漂浮物；

則再次取滅菌后的第二液體培養基，并將待測物質加入第二液體培養基中，形成第三液體培養基；將第三液體培養基加入無菌平板中，并將試驗菌種液按照0.08％-0.1％的接種量滴加在該培養基的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養，分別在12h、24h、48h、72h觀察薄皮的形成；如果在第三液體培養基上能夠在12h～24h內形成薄皮或超過72h能在第三液體培養基上形成完整的漂浮物，則得出待測物質具有生物被膜促進能力；反之亦然。