[發(fā)明專利]芽胞桿菌生物被膜形成能力評估方法及應(yīng)用的培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610064177.7
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN105543325B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻國輝;李一平;沈漢國;劉文;陳繼敏;劉蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12R1/07;C12R1/125;C12R1/01
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務(wù)所 44291
• 代理人: 楊煥軍

1.一種評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括：

第一液體培養(yǎng)基，所述第一液體培養(yǎng)基包含的溶質(zhì)及濃度為，100mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，1mM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％胰蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調(diào)整pH為7.0；所述第一液體培養(yǎng)基的最終pH為7.0；

第二液體培養(yǎng)基，所述第二液體培養(yǎng)基包含的溶質(zhì)及濃度為，100mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，1mM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3％牛肉膏，0.5％NaCl，1％細(xì)菌學(xué)蛋白胨，0.1％葡萄糖；在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調(diào)整pH為7.0；所述第二液體培養(yǎng)基的最終pH為7.0。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養(yǎng)基，其特征在于，在第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基中分別加入1.5％的瓊脂制成第一固體培養(yǎng)基和第二固體培養(yǎng)基。

3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

將待測菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，在37℃下以180rpm的速度振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，使菌液的OD₆₀₀值達(dá)到0.8以上；

然后用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋菌液，使菌液的OD₆₀₀達(dá)到0.02，用作待測菌種液，要求待測菌種液中芽胞桿菌的濃度達(dá)到10⁶CFU/mL以上；

將滅菌后的第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基分別加入無菌平板中，將待測菌種液按照0.08％～0.1％的接種量滴加在2種培養(yǎng)液的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養(yǎng)，分別在12h、24h、 48h、72h觀察薄皮的形成；

如果能夠在第一液體培養(yǎng)基中形成完整的薄皮，但不能在第二液體培養(yǎng)基中形成完整薄皮的菌株，判定為屬于生物被膜形成能力中等菌株；

如果在第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基中僅能形成漂浮的殘缺不全的薄皮，則判定為無生物被膜形成能力或生物被膜形成能力弱的菌株；

如果能夠同時(shí)在第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基中形成薄皮的，則判定為生物被膜形成能力強(qiáng)的菌株；

在第一液體培養(yǎng)基中越早形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定薄皮的菌株，則被判定為生物被膜形成能力越強(qiáng)。

4.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基評估促進(jìn)芽胞桿菌生物被膜形成能力的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

將選取的芽胞桿菌菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，在37℃下以180rpm的速度振蕩培養(yǎng)，20小時(shí)，使菌液的OD₆₀₀值達(dá)到0.8以上；

然后用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋菌液，使菌液的OD₆₀₀達(dá)到0.02，用作試驗(yàn)菌種液，要求試驗(yàn)菌種液中芽胞桿菌的濃度達(dá)到10⁶CFU/mL以上；

將滅菌后的第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基分別加入無菌平板中，將試驗(yàn)菌種液按照0.08％-0.1％的接種量滴加在2種培養(yǎng)基的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養(yǎng)，分別在12h、24h、 48h、72h觀察薄皮的形成；

觀察如果在第一液體培養(yǎng)基上能夠在12h～24h內(nèi)形成薄皮，但不能在第二液體培養(yǎng)基上在12h～24h內(nèi)形成薄皮的或超過72h僅在第二液體培養(yǎng)基上形成破碎的不完整漂浮物；

則再次取滅菌后的第二液體培養(yǎng)基，并將待測物質(zhì)加入第二液體培養(yǎng)基中，形成第三液體培養(yǎng)基；將第三液體培養(yǎng)基加入無菌平板中，并將試驗(yàn)菌種液按照0.08％-0.1％的接種量滴加在該培養(yǎng)基的表面，蓋上皿蓋后30℃靜置培養(yǎng)，分別在12h、24h、48h、72h觀察薄皮的形成；如果在第三液體培養(yǎng)基上能夠在12h～24h內(nèi)形成薄皮或超過72h能在第三液體培養(yǎng)基上形成完整的漂浮物，則得出待測物質(zhì)具有生物被膜促進(jìn)能力；反之亦然。