[發明專利]一種肝細胞癌患者外周血GPC3檢測方法

有效

• 申請號: 201610061400.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105717104B
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 崔凱;李勝;王振丹
• 申請（專利權）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/28;G01N1/36
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 黎明

本發明公開了一種肝細胞癌患者外周血GPC3檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的肝癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，進而檢測GPC3表達情況。通過該技術方法，不用取材肝癌組織即可檢測到肝癌患者外周血中GPC3表達情況，為肝細胞癌診斷提供依據。該技術屬于微創甚至無創，并能夠實時檢測。

技術領域

本發明涉及一種檢測外周血GPC3的方法，尤其對未獲得病理診斷的肝細胞癌患者，通過檢測外周血中GPC3，進一步明確肝細胞癌診斷。

背景技術

GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)是一種膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)，相對分子質量約66kDa，其基本結構包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)鏈和糖基磷脂酰肌醇(GPI)，通過GPI錨定于細胞表面，可以結合多種生長因子并調節其活性，進而在生長發育和癌變過程中起關鍵作用。GPC3主要通過Wnts信號途徑產生作用，GPC3在正常組織中表達及分布有明顯的組織特異性和組織分化的時相特異性。研究表明在人體的胚胎期，胎盤和胎兒組織中富含GPC3mRNA，胃腸道和肝、腎和肺中都有GPC3的高度表達，其中以肝臟表達水平最高。而在成人，GPC3高表達在胎盤組織，在卵巢、腎臟、肺臟、心臟等少數組織呈低水平表達，不表達于正常的肝臟組織。研究證實GPC3蛋白在肝癌組織中高表達，而在非癌組織中沒有表達或表達量極低，說明GPC3和肝癌有特定的關系，GPC3具有抑制腫瘤的生長，更加說明GPC3在肝癌表達的特異性和在肝癌作用機制的特異性；同時還有研究表明GPC3在肺癌、乳腺癌、間皮瘤、腎癌和卵巢癌組織中表達缺失。有研究表明研究顯示:GPC3在80％-90％肝癌組織中表達顯著上調，在正常成人組織及肝炎、肝硬化患者組織和其它腫瘤中低水平表達或不表達，在AFP陰性的HCC中也有較高表達。對肝癌、肝細胞癌、肝硬化再生性瘤、結節增生的肝組織進行免疫組化檢測，發現肝癌組織中GPC3陽性率達75.7％，而在良性腫瘤中GPC3陰性。GPC3在90％的HCC中呈陽性，且特異性高達100％，但在轉移性肝癌和良性肝病中陰性。因此，GPC3不僅可以用于鑒別腫瘤的良、惡性，還可以鑒別HCC與轉移性肝癌。

目前肝細胞癌的診斷包括病理學診斷和臨床診斷，病理學診斷是肝癌診斷的金標準，臨床診斷標準主要包括慢性肝病背景、影像學檢查結果和血清腫瘤標記物水平三方面內容。但對于無法獲得病理診斷或臨床診斷依據不充分的部分肝癌患者，檢測GPC3的表達狀況變得十分困難。

發明內容

循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體腫瘤脫落而進入外周血液循環的腫瘤細胞，聚集成團形成循環腫瘤微栓(Circulating tumor thrombus，CTM)，它們存在于多種惡性腫瘤中，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時等特點，被稱為“液態活檢”。

為了克服臨床診斷依據不足的肝癌患者不適宜組織標本取材或避免穿刺活檢造成腫瘤播散等問題，無法明確肝癌診斷的不足，本發明提供了一種肝細胞癌患者外周血GPC3檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的肝癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，進而檢測GPC3表達情況。

本發明所采用的技術方案如下：

一、利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的肝癌患者外周血中的CTC：

1、采集晚期肝癌患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2、外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25％；

3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；