[發(fā)明專利]一種肝細(xì)胞癌患者外周血GPC3檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610061400.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105717104B
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔凱;李勝;王振丹
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/28;G01N1/36
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 黎明

1.一種肝細(xì)胞癌患者外周血GPC3檢測方法，其特征在于，檢測方法步驟如下：利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標(biāo)本的肝癌患者外周血中的CTC；運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片；進(jìn)而檢測GPC3表達(dá)情況；

所述的利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標(biāo)本的肝癌患者外周血中的CTC，其方法步驟如下：

1)采集晚期肝癌患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2)外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25％；

3)利用膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自然過濾；

4)過濾結(jié)束后，從膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置中取下濾器(3)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液加入到濾器(3)中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，取下濾膜(7)，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

所述的運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切片，其方法步驟如下：

1)脫色：從載玻片上取下帶有CTC的濾膜(7)，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按容積比1:1混勻；

2)包裹：浸泡結(jié)束后取出濾膜(7)，用吸水紙包裹；

3)固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4)浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì)胞石蠟塊；

5)薄層切片：用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為4μm的薄層切片；

所述的檢測GPC3表達(dá)情況，方法步驟如下：

1)烤片：將CTC蠟塊薄層切片在60℃恒溫箱中烤片2小時；

2)脫蠟：切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘；

3)水化：將切片依次在無水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分別放置1分鐘，自來水、蒸餾水沖洗；

4)抗原修復(fù)：將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液EDTA煮沸，放入切片至完全沒入修復(fù)液蓋上高壓鍋蓋及壓力閥，加熱至高壓鍋噴氣后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修復(fù)液中自然冷卻；

5)蒸餾水沖洗；

6)去除內(nèi)源性過氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分鐘；

7)蒸餾水沖洗；

8)PBS浸洗5次各1.5分鐘；

9)滴加GPC3一抗；

10)4℃冰箱中過夜；

11)PBS浸洗5次各1.5分鐘；

12)滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體；

13)37℃水浴鍋中孵育20分鐘；

14)PBS浸洗5次各1.5分鐘；

15)顯微鏡下控制，DAB顯色；

16)自來水沖洗，蘇木精染液復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)；

17)自來水沖洗5分鐘；

18)50％、70％、85％、95％、100％梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片；

19)細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，判讀GPC3表達(dá)情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞癌患者外周血GPC3檢測方法，其特征在于，所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、廢液缸(5)和鐵架臺(1)，所述鐵架臺(1)設(shè)有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血樣容器(2)通過支架(13)設(shè)置于鐵架臺(1)上部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯(lián)通至廢液缸(5)，廢液缸(5)設(shè)置于底座(11)上。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝細(xì)胞癌患者外周血GPC3檢測方法，其特征在于：所述濾器(3)包括濾器上口(6)、濾膜(7)、載濾膜平臺(8)和濾器下口(9)，濾膜(7)置于載濾膜平臺（8） 上；濾器上口(6)接血樣容器(2)，濾器下口(9)通過輸液器(4)接廢液缸(5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝細(xì)胞癌患者外周血GPC3檢測方法，其特征在于：所述濾膜(7)為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔(10)。