[發明專利]一種進行固相PCR反應的自動化微流工作站及方法

在審

• 申請號: 201610061168.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105505766A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 張一桐;李鵬鑫;張祥林;胡秋萍;于丹;陳勇
• 申請（專利權）人: 上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12N15/10
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種基于微流控芯片的固相PCR&單堿基延伸反應， 對接核酸質譜檢測，主要應用于單核苷酸多態性檢測，尤其是一種適用于一站式自動化、多 樣本、高通量、快反應、低成本的SNP檢測樣本前處理，可與核酸質譜檢測儀如MALDI-TOF-MS 直接對接，進行SNP位點檢測。

背景技術

單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)是指個體基因組內特定核苷酸 位置上的單個堿基A，T，C，G的改變而引起的DNA序列的改變或突變，這種突變包括單 堿基的轉換、顛換、插入或缺失等。嚴格來說，只有當等位基因的頻率大于或等于1％時才 能稱得上是SNPs，然而部分SNPs數據庫如HGVBase把等位基因的頻率小于1％的變異也包 括在SNPs內。研究表明，人類每對等位染色體上每1000bp就會出現1個SNP，而整個人類 基因組每300bp就會出現1個SNP，在任意兩個個體之間，就有好幾百萬的單堿基差異和十 萬個氨基酸的不同，在一定程度上反映了人類個體或群體的特異性，也造成人類在內的物種 之間染色體基因組的多樣性。

對人類基因組的SNP進行大規模的研究具有重要的意義，它不僅可以研究人類的起源、 進化和群體遺傳學特征，而且為多基因病和復雜性疾病如人類腫瘤、糖尿病、心血管疾病、 自身免疫性疾病、精神病、老年性癡呆等相關基因的研究和藥物遺傳學的研究提供了科學基 礎和先進手段。SNP檢測是目前基因診斷的主要研究內容。同時，SNP檢測所代表的基因診 斷也逐漸成為新生兒或特定人群遺傳病篩查的重要手段之一。

由于SNP其重要性，并且隨著SNP研究的普及和深入，SNP的檢測方法目前已有了長 遠的發展，如全基因組測序，外顯子組測序，全基因組SNP芯片，質譜法，SNPseq法，SNPlex， SNaPshot等，都可以快速、高效、較大通量檢測基因組中的SNP，但這些設備價格昂貴，僅 適用于大型實驗室的研究，難以在普通實驗室進行普及。

質譜法是SNP位點檢測的常用方法和最具前景的技術。質譜法是通過對物質的分子量 (質荷比)進行檢測，達到區分、鑒別物質的目的。SNP位點兩個等位基因之間存在分子量 差異，通過分型實驗將差異放大，然后以質譜儀進行檢測即可達到SNP分型的目的。其主 要是在緊挨SNP位點設計一段探針，在反應體系中以雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP， dideoxy-nucleosidetriphosphate)替代dNTP脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP，deoxy-nucleotide thiophosphate))，使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止。根據SNP位點的不同，探 針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質譜儀可以檢測出這種微小的分子量差異， 從而實現SNP分型的目的。

其中，MassARRAY時間飛行質譜生物芯片系統由專業生產生物芯片系統用于遺傳突變及 SNP領域研究的美國Sequenom公司開發，是目前采用質譜法直接檢測SNP的成熟設備。該 系統的突出特點是能以極高的精確度進行基因型識別，直接測出帶有SNP或其他突變的目 標DNA。由于質譜法直接檢測分子的本質特征-分子量，不需要通過熒光標記來進行間接檢 測，準確可靠；靈敏度高，可檢測低至10ng的核酸片段。然而，國外公司利用質譜儀對SNPs 位點進行檢測的方法，在樣本前處理過程中存在不少缺陷。如Sequenom的標準流程采用的 是兩步PCR：普通PCR預擴增和單堿基延伸PCR擴增，即放大含待檢測SNP位點的ssDNA 模板和放大含SNP位點的延伸產物；PCR預擴增需要45個循環，單堿基延伸循環需要40 個外循環且每個外循環又內嵌5個內循環反應；且在兩次PCR擴增之間，還需要使用蝦堿 性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP)消化除去第一次PCR反應體系中剩余的dNTP 和引物；這樣就造成樣本處理時間的延長、試劑消耗及檢測成本的增加，尤其整個流程操作 需要長達10個小時左右，不利于樣本的即時檢測。