[發明專利]一種進行固相PCR反應的自動化微流工作站及方法

在審

• 申請號: 201610061168.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105505766A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 張一桐;李鵬鑫;張祥林;胡秋萍;于丹;陳勇
• 申請（專利權）人: 上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12N15/10
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種自動進行固相PCR反應的微流工作站，所述工作站包括：

至少一個微流控芯片，芯片含有一個或多個獨立的反應通道，每一反應通道包括進出口、 一個或多個串聯或并聯的反應腔室和/或流道，反應腔室底面錨定有寡核苷酸序列，以進行 固相PCR擴增和/或固相單堿基延伸反應；

液路系統，以控制引入不同反應試劑溶液流至對應的反應腔室；

溫控裝置，以控制調節所述反應腔室內的溫度；

控制系統，其連接上述液路系統和溫控裝置，用于控制液路系統和溫控裝置，在微流控 芯片的反應腔室內進行的固相PCR擴增和固相單堿基延伸反應，并包括變性-洗脫反應和洗 脫-變性反應。

2.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上蓋、反應 通道和基底，上蓋設有反應通道的進出口，基底進行刻蝕挖槽成反應通道，通道長度為 2-8cm，深度為50um-200um，寬度為0.5mm～3mm，單個反應通道的反應體系總體積為 5ul～20ul。

3.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上蓋、通道 柵欄和基底，上蓋設有反應通道的進出口，上蓋-通道柵欄-基底的“三明治結構”形成多個 獨立的反應通道。

4.根據權利要求2和3所述的微流控芯片，其特征在于，通過對分層結構的鍵合封裝， 形成可進出流通的封閉反應腔室。

5.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片材質為包括金屬、 玻璃、硅片和聚合物的至少一種或組合組成，其容納流體的有效結構至少在一個維度上為微 米級尺度，微流控芯片處于多個的狀態下，各個微流控芯片分別獨立與控制系統連接。

6.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片的固相襯底為平 面結構，可錨定高密度的一種或多種寡核苷酸序列，所述固相襯底平鋪錨定寡核苷酸序列是 通過羧基/醛基/環氧基-氨基、鏈霉親和素-生物素在內的多種化學修飾中的至少一種完成。

7.根據權利要求6所述的微流工作站，其特征在于，所述錨定在芯片通道底面的寡核 苷酸序列是PCR擴增所需的反向引物。

8.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述的固相單堿基延伸反應包括 發生一個或多個退火-延伸反應。

9.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述溫控裝置設置在芯片反應腔 室的底面。

10.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述液路系統包括設置各種所述 試劑的容器、與反應通道相連的通路及控制閥，所述試劑包括用于PCR擴增的正向引物/單 堿基延伸引物、脫氧核糖核苷三磷酸/雙脫氧核糖核苷三磷酸、反應酶、反應緩沖液和清洗 緩沖液在內，控制系統與此控制閥相連接，以控制閥門的開關或通路流量的大小。

11.根據權利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述控制系統包括電力提供裝置、 控制器、采集器、顯示裝置和/或輸出裝置，電力提供裝置給微流工作站提供電力，控制器 連接采集器，顯示裝置和/或輸出裝置，并連接液路系統和溫控裝置。

12.一種基于權利要求1所述的基于微流控芯片實現固相PCR反應的方法，其特征在 于，包括以下步驟：

A:在微流控芯片的每一反應通道的固相襯底上發生固相PCR擴增反應；

B:在經過變性處理及洗脫后，目標單鏈DNA片段固定在固相襯底；

C:進行固相單堿基延伸反應，并對延伸產物進行提純分離。

13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，步驟A進一步包括：

控制系統將含有PCR反應液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物在內的混合液由液路系 統引入固相襯底錨定連接有反向引物的反應腔室，

控制系統控制溫控系統在經過若干次的變性、退火、延伸后生成含有反向引物的目標單 鏈DNA和含有正向引物的互補單鏈DNA，兩條單鏈DNA可互補生成雙鏈DNA，并通過反向 引物固定在通道底面。