[發明專利]一種人體微生物定性與定量的檢測方法

在審

• 申請號: 201610061014.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105671150A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 彭海;張英;盧龍
• 申請（專利權）人: 江漢大學;辛辛那提兒童醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;C12Q1/70
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人體微生物定性與定量的檢測方 法。

背景技術

人體微生物是人體疾病診斷的重要依據，人體微生物精確地定性與定量檢 測是十分必要的。

現有人體微生物定性與定量檢測技術包括形態學計數、芯片檢測、16SrRNA 測序、宏基因組測序和實時定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈式 反應)。形態學計數檢測需要對微生物進行預培養，耗時長，不可培養微生物不 可檢測，一次僅能夠檢測一種微生物，通量低，在計數時抽樣量有限，且結果 粗糙，無法對種以下的分類單元進行區分。芯片檢測所需的待測樣品的DNA量 大，需要對微生物進行預培養及富集處理，檢測結果不準確，且無法做定量檢 測。16SrRNA測序無法對種以下的分類單元進行區分。宏基因組測序深度有限， 對于低含量的微生物的定量檢測準確度很差。實時定量PCR一次只能檢測一種 微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無法計算微生物定性與定量的 可靠性，使得結論實用性差。以上技術缺陷導致了人體疾病診斷不及時、診斷 不精確以及誤診等問題。

發明內容

為了解決現有技術中微生物定性與定量檢測不準確的問題，本發明實施例 提供了一種人體微生物定性與定量的檢測方法。所述技術方案如下：

本發明實施例提供了一種人體微生物定性與定量的檢測方法，所述方法包 括：

確定待測樣品中的目標微生物類群、目標微生物和非目標生物、以及不存 在于所述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為人體組織、體液和排泄物；

根據所述目標微生物類群、所述目標微生物、所述參考微生物和所述非目 標生物的參考基因組序列，獲得所述目標微生物類群的特征區域、所述目標微 生物的特征區域和所述參考微生物的特征區域；

制備擴增所述目標微生物類群的特征區域的第一多重擴增引物、擴增所述 目標微生物的特征區域的第二多重擴增引物和擴增所述參考微生物的特征區域 的第三多重擴增引物，將所述第一多重擴增引物、所述第二多重擴增引物和所 述第三多重擴增引物混合得到混合多重擴增引物；

向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；

提取所述混合樣品的核酸；

利用所述混合多重擴增引物和所述混合樣品的核酸進行擴增反應，獲得擴 增產物；

利用所述擴增產物進行高通量測序，獲得高通量測序片段；

根據所述高通量測序片段，對所述目標微生物類群和所述目標微生物進行 定性和定量分析。

具體地，所述目標微生物類群的數目≥1個，且每個所述目標微生物類群包 括≥0種所述目標微生物；

所述目標微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原 體、螺旋體和原生動物中的至少一種；

所述參考微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原 體、螺旋體和原生動物中的至少一種。

具體地，所述確定待測樣品中的非目標生物的方法包括：將所述非目標生 物確定為除所述目標微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目標微生物類 群的特征區域，則所述非目標生物指除所述目標微生物類群之外的所有生物； 若不能獲得所述目標微生物類群的特征區域，則所述非目標生物指所述混合樣 品中，除所述目標微生物類群之外的其它生物。

具體地，所述目標微生物類群的特征區域為所述目標微生物類群內的微生 物的參考基因組上的核酸序列；所述目標微生物類群的特征區域的兩側的序列 在所述參考基因組中為單一序列；所述目標微生物類群的特征區域的兩側的序 列在所述目標微生物類群內不同微生物間保守；所述目標微生物類群的特征區 域的區分度≥3；

所述目標微生物的特征區域與所述目標微生物類群的特征區域同源；所述 目標微生物的特征區域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標微生物的特征區域 與所述目標微生物類群內除所述目標微生物外的其它所述微生物間的差異堿基 數的最小值；