[發明專利]一種人體微生物定性與定量的檢測方法

在審

• 申請號: 201610061014.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105671150A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 彭海;張英;盧龍
• 申請（專利權）人: 江漢大學;辛辛那提兒童醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;C12Q1/70
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

1.一種人體微生物定性與定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括：

確定待測樣品中的目標微生物類群、目標微生物和非目標生物、以及不存 在于所述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為人體組織、體液和排泄物；

根據所述目標微生物類群、所述目標微生物、所述參考微生物和所述非目 標生物的參考基因組序列，獲得所述目標微生物類群的特征區域、所述目標微 生物的特征區域和所述參考微生物的特征區域；

制備擴增所述目標微生物類群的特征區域的第一多重擴增引物、擴增所述 目標微生物的特征區域的第二多重擴增引物和擴增所述參考微生物的特征區域 的第三多重擴增引物，將所述第一多重擴增引物、所述第二多重擴增引物和所 述第三多重擴增引物混合得到混合多重擴增引物；

向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；

提取所述混合樣品的核酸；

利用所述混合多重擴增引物和所述混合樣品的核酸進行擴增反應，獲得擴 增產物；

利用所述擴增產物進行高通量測序，獲得高通量測序片段；

根據所述高通量測序片段，對所述目標微生物類群和所述目標微生物進行 定性和定量分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標微生物類群的數目 ≥1個，且每個所述目標微生物類群包括≥0種所述目標微生物；

所述目標微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原 體、螺旋體和原生動物中的至少一種；

所述參考微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原 體、螺旋體和原生動物中的至少一種。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定待測樣品中的非目 標生物的方法包括：將所述非目標生物確定為除所述目標微生物類群之外的所 有生物，若能獲得所述目標微生物類群的特征區域，則所述非目標生物指除所 述目標微生物類群之外的所有生物；若不能獲得所述目標微生物類群的特征區 域，則所述非目標生物指所述混合樣品中，除所述目標微生物類群之外的其它 生物。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標微生物類群的特征 區域為所述目標微生物類群內的微生物的參考基因組上的核酸序列；所述目標 微生物類群的特征區域的兩側的序列在所述參考基因組中為單一序列；所述目 標微生物類群的特征區域的兩側的序列在所述目標微生物類群內不同微生物間 保守；所述目標微生物類群的特征區域的區分度≥3；

所述目標微生物的特征區域與所述目標微生物類群的特征區域同源；所述 目標微生物的特征區域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標微生物的特征區域 與所述目標微生物類群內除所述目標微生物外的其它所述微生物間的差異堿基 數的最小值；

所述參考微生物的特征區域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列； 所述參考微生物的特征區域的兩側的序列在所述參考微生物的參考基因組中為 單一序列；所述參考微生物的特征區域的兩側的序列在除所述參考微生物外的 其它生物中不具有同源性。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述區分度是指由同一所述 混合多重擴增引物擴增的任一所述目標微生物類群的特征區域與任一非特征區 域間的差異堿基數的最小值，其中，所述非特征區域是所述混合多重擴增引物 以所述混合樣品的核酸為模板的擴增產物，且所述非特征區域不為所述目標微 生物類群的特征區域，若無所述非特征區域，則所述區分度＝3×L1/4，其中，L1 為所述目標微生物類群的特征區域的核酸序列長度。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：

在提取所述混合樣品的核酸時，若所述待測樣品中核酸的含量過低，則在 提取所述混合樣品的核酸的過程中，加入所述混合多重擴增引物不能擴增的外 源核酸。