[發(fā)明專(zhuān)利]快速檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光RPA試劑盒、試紙條RPA試劑盒及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610060957.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105525040B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張志東;楊洋;秦曉東;孫英軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光RPA試劑盒及其用途，還公開(kāi)了一種快速檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒的試紙條RPA試劑盒及其用途。該兩種試劑盒分別包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探針，雖然針對(duì)同一靶標(biāo)序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測(cè)平臺(tái)不同。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的兩個(gè)試劑盒的敏感性均為10²拷貝/反應(yīng)，并均只能特異性檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒。分別用本發(fā)明的兩個(gè)試劑盒檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒疑似樣品，結(jié)果表明這兩個(gè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與qPCR的符合度均為100％。因此，本發(fā)明的兩個(gè)試劑盒均能快捷、高效、靈敏的檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒，為豬2型圓環(huán)病毒的鑒別診斷提供了有效技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于RPA反應(yīng)的用于快速檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒的實(shí)時(shí)熒光RPA試劑盒以及試紙條RPA試劑盒，還涉及二者在快速檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒中的用途，本發(fā)明屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自PCR技術(shù)誕生以來(lái)已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術(shù)需要特殊昂貴的熱循環(huán)儀器以及熟練的操作人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以用在現(xiàn)場(chǎng)診斷以及實(shí)驗(yàn)條件差的地方。在發(fā)展中國(guó)家實(shí)驗(yàn)室中，由于PCR實(shí)施所需要的基礎(chǔ)設(shè)備和技術(shù)所限，大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家仍然集中在使用傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，比如血清學(xué)方法、顯微鏡技術(shù)，或者培養(yǎng)以及鑒定傳染性以及非傳染性疾病。為了填補(bǔ)傳統(tǒng)方法和PCR之間的空缺，新的等溫分子診斷技術(shù)正在開(kāi)發(fā)，該方法尤其適用于基礎(chǔ)設(shè)施、實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及試驗(yàn)技術(shù)難于支持使用PCR進(jìn)行診斷的地方。

與常規(guī)方法相比較，等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性，這些原因促使不同的公司商業(yè)化不同的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，比如，環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification,BectonDickson,USA)。在這些技術(shù)中，LAMP是使用最為廣泛，且最成熟的試驗(yàn)方法。與RPA方法相比較，LAMP技術(shù)具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較麻煩(3對(duì)引物)，特異性相對(duì)較弱(能擴(kuò)增很多條帶)，時(shí)間仍然相對(duì)較長(zhǎng)，以及易于污染等不足的地方。

英國(guó)TwistDx Inc公司開(kāi)發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品能夠在15分鐘內(nèi)，37℃-42℃之間進(jìn)行核酸檢測(cè)。現(xiàn)在使用最多的、最為成熟的為進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的體系(如exo試劑盒，real-time RPA)以及基于試紙條的終點(diǎn)檢測(cè)(nfo試劑盒，Recombinase Polymerase Amplification Assaycombined with lateral flow test，LFS RPA)。

實(shí)時(shí)熒光RPA(real-time RPA)試驗(yàn)需要能激發(fā)并檢測(cè)熒光基團(tuán)的恒溫儀器，比如酶標(biāo)儀或?qū)崟r(shí)檢測(cè)的熱循環(huán)儀。自開(kāi)發(fā)以來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類(lèi)疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于土拉弗朗西斯菌、細(xì)螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原的檢測(cè)。

對(duì)于試紙條RPA(LFS RPA)試驗(yàn)而言，只要溫度能控制在37-42℃之間就行，比如可以在水浴鍋等設(shè)置中進(jìn)行反應(yīng)，或者直接用人的體溫進(jìn)行加熱，隨后可以通過(guò)側(cè)流層析試紙條LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)讀取試驗(yàn)結(jié)果。自開(kāi)發(fā)以來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類(lèi)疾病、獸醫(yī)藥物、食品工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中，比如用于感染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、惡性瘧原蟲(chóng)、洋李痘皰病毒、羌蟲(chóng)、力克次體、隱孢子蟲(chóng)以及黃熱病毒等的檢測(cè)。與常規(guī)方法相比較，該實(shí)驗(yàn)具有很高的敏感性和特異性。