[發(fā)明專利]一種水體微生物定性與定量的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610060835.5
• 申請(qǐng)日: 2016-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105713967B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張靜;方治偉;彭海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/04;C12Q1/06
• 代理公司: 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11138
• 代理人: 徐立

本發(fā)明公開(kāi)了一種水體微生物定性與定量的檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括以下步驟：確定待測(cè)樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待測(cè)樣品中的參考微生物；設(shè)計(jì)目標(biāo)微生物類群與目標(biāo)微生物的特征區(qū)域；設(shè)計(jì)特征區(qū)域的多重?cái)U(kuò)增引物；在待測(cè)樣品中加入?yún)⒖嘉⑸锱c外源核酸后，提取待測(cè)樣品中的微生物的核酸；利用設(shè)計(jì)的多重引物擴(kuò)增微生物核酸，擴(kuò)增獲得特征測(cè)序片段；利用特征測(cè)序片段定性、定量分析待測(cè)樣品中微生物。本發(fā)明不需要對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)與增殖，可以一次性地對(duì)待測(cè)樣品中的多種已知微生物進(jìn)行高通量、高準(zhǔn)確度、高分辨率的檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速且流程規(guī)范。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水體微生物定性與定量的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

水體微生物是水體質(zhì)量的指標(biāo)，也是人畜病原菌的重要來(lái)源，因此，水體微生物精確地定性與定量檢測(cè)與監(jiān)控是十分必要的。

現(xiàn)有水體微生物定性與定量檢測(cè)技術(shù)包括形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)、芯片檢測(cè)、16S rRNA測(cè)序、宏基因組測(cè)序和實(shí)時(shí)定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)檢測(cè)需要對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，不可培養(yǎng)微生物不可檢測(cè)，一次僅能夠檢測(cè)一種微生物，通量低，在計(jì)數(shù)時(shí)抽樣量有限，且結(jié)果粗糙，無(wú)法對(duì)種以下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。芯片檢測(cè)所需的待測(cè)樣品的DNA量大，需要對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)及富集處理，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，且無(wú)法做定量檢測(cè)。16S rRNA測(cè)序無(wú)法對(duì)種以下的分類單元進(jìn)行區(qū)分。宏基因組測(cè)序深度有限，對(duì)于低含量的微生物的定量檢測(cè)準(zhǔn)確度很差。實(shí)時(shí)定量PCR一次只能檢測(cè)一種微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無(wú)法計(jì)算微生物定性與定量的可靠性，使得結(jié)論實(shí)用性差。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物定性與定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種水體微生物定性與定量的檢測(cè)方法。所述技術(shù)方案如下：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種水體微生物定性與定量的檢測(cè)方法，所述方法包括：

確定待測(cè)樣品中的目標(biāo)微生物類群、目標(biāo)微生物和非目標(biāo)生物、以及不存在于所述待測(cè)樣品中的參考微生物，所述待測(cè)樣品為水體；

根據(jù)所述目標(biāo)微生物類群、所述目標(biāo)微生物、所述參考微生物和所述非目標(biāo)生物的參考基因組序列，獲得所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域、所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域和所述參考微生物的特征區(qū)域；

制備擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物類群的特征區(qū)域的第一多重?cái)U(kuò)增引物、擴(kuò)增所述目標(biāo)微生物的特征區(qū)域的第二多重?cái)U(kuò)增引物和擴(kuò)增所述參考微生物的特征區(qū)域的第三多重?cái)U(kuò)增引物，將所述第一多重?cái)U(kuò)增引物、所述第二多重?cái)U(kuò)增引物和所述第三多重?cái)U(kuò)增引物混合得到混合多重?cái)U(kuò)增引物；

向所述待測(cè)樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；

提取所述混合樣品的核酸；

利用所述混合多重?cái)U(kuò)增引物和所述混合樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得高通量測(cè)序片段；

根據(jù)所述高通量測(cè)序片段，對(duì)所述目標(biāo)微生物類群和所述目標(biāo)微生物進(jìn)行定性和定量分析。

具體地，所述目標(biāo)微生物類群的數(shù)目≥1個(gè)，且每個(gè)所述目標(biāo)微生物類群包括≥0種所述目標(biāo)微生物；

所述目標(biāo)微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類和原生動(dòng)物中的至少一種；

所述參考微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、藻類和原生動(dòng)物中的至少一種。