[發明專利]一種水體微生物定性與定量的檢測方法

有效

• 申請號: 201610060835.5
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105713967B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 張靜;方治偉;彭海
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04;C12Q1/06
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

1.一種水體微生物定性與定量的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：

確定待測樣品中的目標微生物類群、目標微生物和非目標生物、以及不存在于所述待測樣品中的參考微生物，所述待測樣品為水體；

根據所述目標微生物類群、所述目標微生物、所述參考微生物和所述非目標生物的參考基因組序列，獲得所述目標微生物類群的特征區域、所述目標微生物的特征區域和所述參考微生物的特征區域；

制備擴增所述目標微生物類群的特征區域的第一多重擴增引物、擴增所述目標微生物的特征區域的第二多重擴增引物和擴增所述參考微生物的特征區域的第三多重擴增引物，將所述第一多重擴增引物、所述第二多重擴增引物和所述第三多重擴增引物混合得到混合多重擴增引物；

向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；

提取所述混合樣品的核酸；

利用所述混合多重擴增引物和所述混合樣品的核酸進行擴增反應，獲得擴增產物；

利用所述擴增產物進行高通量測序，獲得高通量測序片段；

根據所述高通量測序片段，對所述目標微生物類群和所述目標微生物進行定性和定量分析；

所述目標微生物類群和所述目標微生物的定性分析方法如下：

將所述高通量測序片段與每種所述目標微生物類群的特征區域進行比對，當差異堿基數≤n1時，則比對成功，相應的所述高通量測序片段為所述目標微生物類群的特征區域，其中，n1為所述目標微生物類群的特征測序片段的最大容錯堿基數；若比對成功的所述目標微生物類群的特征區域≥1種時，則判斷所述高通量測序片段為所述目標微生物類群的特征測序片段；

將所述目標微生物的特征區域與每種同源的所述目標微生物類群的特征區域進行比對，在所述目標微生物的特征區域中提取差異堿基組成所述目標微生物的標準基因型；在所述目標微生物類群的特征測序片段上，提取所述目標微生物的標準基因型所對應的堿基，組成所述目標微生物的測試基因型；若所述目標微生物的測試基因型與所述目標微生物的標準基因型的差異堿基數≤n2，其中，n2為所述目標微生物的特征測序片段的最大容錯堿基數，則所述目標微生物的測試基因型所在的所述高通量測序片段為所述目標微生物的特征測序片段；

將所述參考微生物作為僅包含一個所述目標微生物的所述目標微生物類群，計算獲得的所述目標微生物的特征測序片段，即為所述參考微生物的特征測序片段；

若所述目標微生物類群的特征測序片段存在的概率P5≥α5，則判斷所述待測樣品中存在所述目標微生物類群，其中，α5為概率保障；若所述目標微生物類群的特征測序片段存在的概率P5α5，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標微生物類群；

若所述目標微生物的特征測序片段存在的概率P6≥α6，則判斷所述待測樣品中存在所述目標微生物，其中，α6為概率保障；若所述目標微生物的特征測序片段存在的概率P6α6，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標微生物；

n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1為一條不是所述目標微生物類群的特征測序片段的所述高通量測序片段被誤判為所述目標微生物類群的特征測序片段而產生的假陽性的概率；P3為一條所述目標微生物類群的特征測序片段被誤判為不是所述目標微生物類群的特征測序片段而產生的假陰性的概率；α1和α3為判斷閾值；

n2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2為一條不是所述目標微生物的特征測序片段的所述高通量測序片段被誤判為所述目標微生物的特征測序片段而產生的假陽性的概率；P4為一條所述目標微生物的特征測序片段被誤判為不是所述目標微生物的特征測序片段而產生的假陰性的概率；α2和α4為判斷閾值；

P5＝1-BINOM.DIST(S1,S1,P1,FALSE)，P6＝1-BINOM.DIST(S3,S3,P2,FALSE)，S1為所有的所述目標微生物類群的特征區域的所述目標微生物類群的特征測序片段的數量的中位數；S3為所有的所述目標微生物的特征區域的所述目標微生物的特征測序片段的數量的中位數，FALSE為參數值；BINOM.DIST函數返回一元二項式分布的概率；

所述目標微生物類群和所述目標微生物的定量分析方法如下：

所述目標微生物類群的量M1＝Mr×S1/S2，所述目標微生物類群的量的置信區間為[M11，M12]，其中，Mr為加入所述待測樣品中的所述參考微生物的量；S2為所有的所述參考微生物的特征區域的所述參考微生物的特征測序片段的數量的中位數；M11和M12分別為M1值的置信區間的下限與上限；

所述目標微生物的量M2＝M1×S3/S1，所述目標微生物的量的置信區間為[M21，M22]，M21和M22分別為M2值的置信區間的下限與上限；

M11＝M1×(1-S4/S1)，M12＝M1×(1+S5/S1)，M21＝M2×(1-S6/S3)，M22＝M2×(1+S7/S3)；其中，S4為假陽性的所述目標微生物類群的特征測序片段的數量且S4＝CRITBINOM(nS,P1,α9)，其中，nS為計算S1的所述目標微生物類群的特征區域的所述多重擴增引物所擴增的所述非特征區域的所述高通量測序片段的數量；S5為假陰性的所述目標微生物類群的特征測序片段的數量且S5＝CRITBINOM(S1,P3,α9)，其中，α9為概率保障；S6為假陽性的所述目標微生物的特征測序片段的數量且S6＝CRITBINOM(S1,P2,α10)，S7為假陰性的所述目標微生物的特征測序片段的數量且S7＝CRITBINOM(S3,P4,α10)，其中，α10為概率保障；CRITBINOM函數返回使累積二項式分布大于等于臨界值的最小值；

所述目標微生物類群的特征區域為所述目標微生物類群內的微生物的參考基因組上的核酸序列；所述目標微生物類群的特征區域的兩側的序列在所述參考基因組中為單一序列；所述目標微生物類群的特征區域的兩側的序列在所述目標微生物類群內不同微生物間保守；所述目標微生物類群的特征區域的區分度≥3；

所述目標微生物的特征區域與所述目標微生物類群的特征區域同源；所述目標微生物的特征區域的m2值≥2，其中，m2值為所述目標微生物的特征區域與所述目標微生物類群內除所述目標微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數的最小值；

所述參考微生物的特征區域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列；所述參考微生物的特征區域的兩側的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列；所述參考微生物的特征區域的兩側的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。