[發(fā)明專利]一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610060833.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN105603073B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李論;高利芬;彭海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 11138 北京三高永信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 徐立

本發(fā)明公開了一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法。所述方法包括：確定耐藥性基因、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因；制備多重?cái)U(kuò)增引物；向待測(cè)樣品中加入外源核酸，得到混合樣品并提取基因組；向基因組中加入外源標(biāo)準(zhǔn)基因，獲得混合核酸；擴(kuò)增混合核酸，利用擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，得到測(cè)序片段組；分析所述測(cè)序片段組，并根據(jù)獲得的外源標(biāo)準(zhǔn)基因和內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功；若實(shí)驗(yàn)成功，則計(jì)算耐藥性基因的含量；根據(jù)耐藥性基因的含量判定待測(cè)樣品是否含有耐藥性基因。所述方法可以一次性定量檢測(cè)任意微生物中的任意多種希望檢測(cè)的耐藥性基因，且檢測(cè)不需要培養(yǎng)與純化微生物，速度快，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

抗生素類藥物廣泛應(yīng)用于防治人體疾病，濫用抗生素類藥物會(huì)導(dǎo)致微生物進(jìn)化出耐藥性基因，并產(chǎn)生耐藥性，這使得抗生素類藥物在防治疾病時(shí)失效。痰液中微生物耐藥性基因是多種疾病特別是呼吸道類疾病用藥的重要依據(jù)。

現(xiàn)有的檢測(cè)耐藥性基因的方法包括：預(yù)估待測(cè)樣品上攜帶的需要檢測(cè)的耐藥性基因的病原菌，分離并純化該病原菌，通過PCR(Polymease Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物擴(kuò)增該耐藥性基因，利用電泳或?qū)崟r(shí)定量PCR方法逐一判斷待測(cè)樣品中是否存在需要檢測(cè)的耐藥性基因。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題中的一種：

需要培養(yǎng)、分離和純化病原菌，使得檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)，延誤治療時(shí)機(jī)；無法檢測(cè)不可培養(yǎng)的耐藥菌中的耐藥性基因；一次只能針對(duì)一種或少數(shù)幾種病原菌進(jìn)行檢測(cè)；一次只能檢測(cè)一種或少數(shù)幾種耐藥性基因，不能檢測(cè)到待測(cè)樣品中所有的耐藥性基因，不能給予用藥所需的全面信息；不能實(shí)現(xiàn)耐藥性基因的定量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)耐藥性基因的方法有待提高的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法。所述技術(shù)方案如下：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測(cè)方法，所述方法包括：

確定待測(cè)樣品中需要檢測(cè)的微生物的耐藥性基因、所述待測(cè)樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述待測(cè)樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，所述待測(cè)樣品為痰液；

制備用于擴(kuò)增所述耐藥性基因、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)試區(qū)域的多重?cái)U(kuò)增引物；

向所述待測(cè)樣品中加入所述多重?cái)U(kuò)增引物不能擴(kuò)增的外源核酸，得到混合樣品；

提取所述混合樣品的基因組；

向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因，獲得混合核酸；

利用所述多重?cái)U(kuò)增引物對(duì)所述混合核酸進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，利用所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)；

對(duì)所述高通量測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到測(cè)序片段組；

分析所述測(cè)序片段組，獲得所述待測(cè)樣品中所述耐藥性基因的測(cè)序片段的數(shù)量、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量；

根據(jù)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功；

若所述實(shí)驗(yàn)成功，則計(jì)算所述待測(cè)樣品中所述耐藥性基因的含量；

根據(jù)所述耐藥性基因的含量判定所述待測(cè)樣品是否含有耐藥性基因。

具體地，所述耐藥性基因至少為1個(gè)，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因至少為1個(gè)。

具體地，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)樗龃郎y(cè)樣品的微生物中的基因。