[發明專利]一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測方法

有效

• 申請號: 201610060833.6
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105603073B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 李論;高利芬;彭海
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 11138 北京三高永信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 徐立

1.一種非診斷目的的痰液微生物耐藥性基因的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：

確定待測樣品中需要檢測的微生物的耐藥性基因、所述待測樣品中的內源標準基因和所述待測樣品的外源標準基因，所述待測樣品為痰液；

制備用于擴增所述耐藥性基因、所述內源標準基因和所述外源標準基因的測試區域的多重擴增引物；

向所述待測樣品中加入所述多重擴增引物不能擴增的外源核酸，得到混合樣品；

提取所述混合樣品的基因組；

向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標準基因，獲得混合核酸；

利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進行擴增，得到擴增產物，利用所述擴增產物構建高通量測序文庫；

對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組；

分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述耐藥性基因的測序片段的數量、所述內源標準基因的測序片段的數量和所述外源標準基因的測序片段的數量，所述外源標準基因的質量與所述混合樣品的基因組的總質量的比例大于1/100000；

根據所述外源標準基因的測序片段的數量和所述內源標準基因的測序片段的數量，判斷實驗是否成功，所述判斷實驗是否成功的方法為：當所述外源標準基因的測序片段的數量和所述內源標準基因的測序片段的數量均≥α1時，則實驗成功；當所述外源標準基因的測序片段的數量或所述內源標準基因的測序片段的數量<α1時，則實驗失敗；其中，α1為判定閾值；

若所述實驗成功，則計算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量，計算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量的方法為：第m種所述耐藥性基因的含量的計算公式為其中，i為第m種所述耐藥性基因的第i個測試區域，n1為所述第m種所述耐藥性基因的測試區域的個數，bi為所述第m種耐藥性基因的第i個測試區域的測序片段的數量，k為第k種所述內源標準基因，n3為所述內源標準基因的個數，j為第k種所述內源標準基因的第j個測試區域，n2為第k種所述內源標準基因的測試區域的個數，aj為第k種所述內源標準基因的第j種測試區域的測序片段的數量；N為所有所述內源標準基因的測試區域的總數；

根據所述耐藥性基因的含量判定所述待測樣品是否含有耐藥性基因，判定所述待測樣品中是否含有所述耐藥性基因的方法為：所述耐藥性基因的含量≥α2時，判定所述待測樣品含有所述耐藥性基因；當所有所述耐藥性基因的含量<α2時，判定所述待測樣品不含有所述耐藥性基因；其中，α2為判定閾值。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述耐藥性基因至少為1個，所述內源標準基因至少為1個，所述外源標準基因至少為1個。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述內源標準基因為所述待測樣品的微生物中的基因。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述外源標準基因不存在于已知基因組的生物中。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，用于擴增所述耐藥性基因的引物的設計區域或擴增區域與所述待測樣品中的生物的基因組的其它區域的同源性低于98％。