[發(fā)明專利]一種定點突變創(chuàng)制糯性玉米種質的方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610060095.5
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN107012163B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發(fā)明（設計）人: 謝傳曉;祁顯濤;劉昌林;劉方;劉文國;路明
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;何葉喧

本發(fā)明公開了一種定點突變創(chuàng)制糯性玉米種質的方法及其應用。本發(fā)明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中導入玉米基因組編輯的載體，得到糯性玉米，所述糯性玉米籽粒中支鏈淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支鏈淀粉含量；玉米基因組編輯的載體含有Cas9蛋白基因、sgRNA編碼基因和RNA聚合酶Ⅲ識別的啟動子。采用本發(fā)明提供的方法能夠實現(xiàn)對玉米的基因編輯，獲得糯性玉米，具有很高的育種和栽培價值。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種定點突變創(chuàng)制糯性玉米種質的方法及其應用。

背景技術

玉米是重要的糧食作物和飼料作物，玉米淀粉在人類生活及工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛，所含的直鏈淀粉和支鏈淀粉具有很高的經(jīng)濟價值。由于支鏈淀粉的理化特性使支鏈淀粉在食品加工、畜牧養(yǎng)殖、造紙業(yè)、紡織業(yè)以及粘著劑工業(yè)等領域具有較大的應用空間，因此培育糯性玉米對生產(chǎn)及加工具有重要意義。

糯性玉米又稱蠟質玉米，是指玉米籽粒成熟后胚乳中支鏈淀粉含量幾乎為100％，且胚乳呈角質不透明且無光澤的蠟質狀，蒸煮后呈黏性故又稱粘玉米。糯性是一個普遍的突變性狀，天然糯性突變體在玉米、水稻、大麥、高粱等二倍體中禾谷類作物中非常常見。糯性玉米獨特的性狀是由受waxy1單基因隱形突變控制的，Sprague等(1943)識別了位于玉米9號染色體短臂的waxy1基因位點，野生型Waxy1基因全長3718bp，由14個外顯子和13個內(nèi)含子構成，編碼顆粒結合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSSI)，該酶主要控制玉米胚乳和花粉的直鏈淀粉合成。如果waxy1基因缺失、表達受阻或GBSSI酶活性降低，將導致胚乳直鏈淀粉合成受阻，胚乳中直鏈淀粉含量降低，從而改變淀粉的糊化和膨脹等特性形成具有糯性性狀的糯性玉米。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過50個waxy1等位基因，突變位置遍布整個waxy1基因，其中相當一部分是不同的轉座子插入相同位置或者相同的轉座子插入不同的位置造成的不穩(wěn)定糯性突變?nèi)鐆x-7、wx-8、wx-9等(klosgen 1986)，還有一些穩(wěn)定的waxy1突變體是在waxy1基因關鍵位置發(fā)生缺失或插入突變，如wx-D7、wx-D10分別是waxy1第7外顯子和第10外顯子發(fā)生堿基缺失導致突變的發(fā)生(fan，2008；田孟良2008)。

CRISPR/Cas9是基于細菌或古細菌規(guī)律成簇的間隔短回文重復CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)介導的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來的基因編輯技術。該技術首先設計的一段sgRNA基因，該基因轉錄的RNA可以通過堿基互補配對識別目標DNA序列，指導Cas9核酸酶切割識別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組(HDR，homologous directed repair)或非同源末端鏈接(NHEJ，non-homologous end-joining)，進而實現(xiàn)目的DNA編輯。基于細菌Ⅱ型免疫機制開發(fā)的基因編輯技術在植物特別是作物遺傳改良上具有重大的應用前景。該技術的基本要求之一就是受體細胞內(nèi)表達單分子識別RNA(sgRNA,single guiding RNA)，該分子負責識別特異性的基因編輯位點，然后介導結合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在設計的位點引入DNA雙鏈斷裂損傷，通過胞內(nèi)的NHEJ或HDR修復途徑引入突變。因此，sgRNA的表達是該技術的重要組成部分。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何培育糯性玉米。

為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了培育糯性玉米(支鏈淀粉含量高的玉米)的方法。

本發(fā)明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中導入玉米基因組編輯的載體，得到糯性玉米。

所述糯性玉米籽粒中支鏈淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支鏈淀粉含量。

所述玉米基因組編輯的載體含有sgRNA編碼基因。

所述sgRNA在玉米中識別的靶標DNA為編碼Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白可為a1)或a2)：