[發(fā)明專利]一種測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610058928.4
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105548301B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陽明輝;申聰聰
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 長沙朕揚(yáng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌

本發(fā)明公開了一種測定蛋白激酶活性的方法，其主要步驟為：選取一組不同濃度的PKA和同一濃度的ATP進(jìn)行反應(yīng)，得到一組PKA反應(yīng)液，再分別將PKA反應(yīng)液和Na₂MoO₄溶液滴加干凈的金電極表面后烘干，再分別對金電極進(jìn)行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應(yīng)的PKA濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同濃度下PKA的活性。本發(fā)明的公開的蛋白激酶抑制劑活性的方法與測定蛋白激酶活性的方法的原理相同。本發(fā)明的方法操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬、且檢測用時短，同時可推廣到其他磷酸水解酶的活性測定，也為高效、快速、低投入地篩選多種有效的PKA抑制劑提供了新的思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用電化學(xué)方法測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法。

背景技術(shù)

蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白的功能。蛋白的磷酸化修飾與眾多生理過程緊密相關(guān)，如信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡等。蛋白激酶是一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⑷姿嵯佘?ATP)上的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)殘基上。蛋白激酶是酶家族的重要成員，活性正常的蛋白激酶體系是細(xì)胞信號傳導(dǎo)運(yùn)作的核心，但當(dāng)其活性異常或者過度表達(dá)時就會引起某些蛋白磷酸化的異常。人類許多疾病就和蛋白磷酸化異常密切相關(guān)，如癌癥、糖尿病及老年癡呆等。由于蛋白激酶調(diào)控著每個組織、每個器官、甚至每個細(xì)胞的生死，從而已成為治療這些復(fù)雜疾病的重要藥物靶點(diǎn)。因此，測定蛋白激酶的活性及篩選蛋白激酶抑制劑在生物醫(yī)學(xué)診斷以及酶靶藥物開發(fā)等領(lǐng)域激起了人們的興趣。

傳統(tǒng)測定蛋白激酶的方法一般都是通過蛋白磷酸化的程度，采用放射性同位素標(biāo)記法、表面等離子共振法、質(zhì)譜法、熒光法和免疫法等來檢測的，這些檢測手段和方法在一定程度上促進(jìn)了對蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素標(biāo)記ATP技術(shù)，檢測方法直接、靈敏度高，但存在放射性污染，不能進(jìn)行組織標(biāo)記；免疫法對磷酸化識別抗體的要求較高，專一性不強(qiáng)、費(fèi)用高。因此，開發(fā)一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高且無需標(biāo)記的蛋白激酶活性檢測及高通量篩選抑制劑方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬、且檢測用時短的利用電化學(xué)方法測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：

一種測定蛋白激酶(PKA)活性的方法，包括以下步驟：

(1)處理金電極：準(zhǔn)備多根金電極并清理干凈金電極表面，然后在金電極表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干備用；

(2)測定蛋白激酶的活性：選取一組不同濃度的蛋白激酶和同一濃度的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)進(jìn)行水浴反應(yīng)，得到一組蛋白激酶反應(yīng)液，再分別將得到的蛋白激酶反應(yīng)液和Na₂MoO₄溶液滴加在步驟(1)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進(jìn)行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應(yīng)的蛋白激酶的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同濃度下蛋白激酶的活性。

上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，ATP濃度為50～500μM，ATP濃度的選取需進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化過程具體為：選取一組不同濃度的ATP分別和同一濃度的蛋白激酶進(jìn)行水浴反應(yīng)，得到一組蛋白激酶反應(yīng)液，再分別將得到的一組蛋白激酶反應(yīng)液和Na₂MoO₄溶液滴加在步驟(1)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進(jìn)行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線分別得到峰電流，選取電信號增加最大時對應(yīng)的ATP濃度即為最優(yōu)的ATP濃度。更優(yōu)選的，ATP濃度為250μM。