[發明專利]一種測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法

有效

• 申請號: 201610058928.4
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105548301B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 陽明輝;申聰聰
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌

1.一種測定蛋白激酶活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）處理金電極：準備多根金電極并清理干凈金電極表面，然后在金電極表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干備用；

（2）測定蛋白激酶的活性：選取一組不同濃度的蛋白激酶和同一濃度的ATP進行水浴反應，得到一組蛋白激酶反應液，再分別將得到的蛋白激酶反應液和Na₂MoO₄溶液滴加在步驟（1）處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據伏安曲線得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應的蛋白激酶的濃度做標準曲線；

（3）根據所述標準曲線計算不同濃度下蛋白激酶的活性；

其中，所述步驟（2）中，所述ATP濃度為50～500μM，Na₂MoO₄溶液的合適濃度范圍為6～10mM；水浴反應的溫度35.5～38.5℃，水浴反應的時間為1～2小時，靜置的時間為10～30min。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，ATP濃度的選取需進行優化，其優化過程具體為：選取一組不同濃度的ATP分別和同一濃度的蛋白激酶進行水浴反應，得到一組蛋白激酶反應液，再分別將得到的一組蛋白激酶反應液和Na₂MoO₄溶液滴加在步驟（1）處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據伏安曲線分別得到峰電流，選取電信號增加最大時對應的ATP濃度即為最優的ATP濃度。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，方波伏安曲線測試的條件為：電解液為0.5M的H₂SO₄，電壓掃描范圍為0.1～0.5V，頻率為15HZ。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，金電極的表面清理過程具體為：將金電極在含Al₂O₃的拋光布上進行拋光，拋光后的金電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗，用氮氣吹干。

5.一種測定蛋白激酶抑制劑活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）處理金電極：準備多根金電極并清理干凈金電極表面，然后在金電極表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干備用；

（2）測定蛋白激酶抑制劑的活性：選用一組不同濃度的蛋白激酶抑制劑分別和同一濃度的蛋白激酶、同一濃度的ATP進行水浴反應，再分別將得到的反應液與Na₂MoO₄溶液滴加在步驟（1）處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行掃方波伏安曲線測試，根據伏安曲線分別得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應的蛋白激酶抑制劑的濃度做擬合曲線；

（3）根據所述擬合曲線計算不同濃度下蛋白激酶抑制劑對蛋白激酶活性的抑制程度；

其中，所述步驟（2）中，所述ATP濃度為50～500μM，Na₂MoO₄溶液的合適濃度范圍為6～10mM；水浴反應的溫度35.5～38.5℃，水浴反應的時間為1～2小時，靜置的時間為10～30min。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，ATP濃度的選取需進行優化，其優化過程具體為：選取一組不同濃度的ATP分別和同一濃度的蛋白激酶進行水浴反應，得到一組蛋白激酶反應液，再分別將得到的一組蛋白激酶反應液和Na₂MoO₄溶液滴加在步驟（1）處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據伏安曲線分別得到峰電流，選取電信號增加最大時對應的ATP濃度即為最優的ATP濃度。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，方波伏安曲線測試的條件為：電解液為0.5M的H₂SO₄，電壓為0.1～0.5V，頻率為15HZ。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，金電極的表面清理過程具體為：將金電極在含Al₂O₃的拋光布上進行拋光，拋光后的金電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗，用氮氣吹干。