[發明專利]一種胃癌患者外周血循環腫瘤細胞Her?2基因的檢測方法

有效

• 申請號: 201610058495.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105588943B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 陸信仰;李勝;仇紅;王愛亮;王振丹
• 申請（專利權）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司37105
• 代理人: 黎明

技術領域

本發明涉及一種檢測Her-2基因的新方法，尤其是通過外周血檢測無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌患者Her-2基因的方法。

背景技術

酪氨酸激酶-人類表皮生長因子受體2(Her-2，又名Her2/neu、c-erbB-2)屬于表皮生長因子受體家族，是細胞內酪氨酸激酶活化的跨膜蛋白。它不同于其他表皮生長因子受體HER-1、HER-3、HER-4，它的配基可連接于細胞內片段。它可以翻譯其他家族成員因此獲得轉磷酸化作用并活化下游信號通路。大部分活化HER-2是通過基因擴增導致HER-2的過度表達，但基因突變也可以導致它的活化。下游由HER-2活化的信號通路主要有：Ras-Raf-MAPK、PI3K-AKT、和STAT通路，這些通路可抑制細胞的凋亡，促進細胞的增殖、轉移、血管生生、侵襲和轉移。研究表明，在早期及進展期胃癌及乳腺癌中過度表達的Her-2(ErbB2)受體已成為胃癌及乳腺癌治療的一個新靶標，而Her-2在不同類型胃癌中的表達率可達60％，超表達的患者可達13％～30％，目前Her-2已成為胃癌治療的必要基因。曲妥珠單抗(赫賽汀)是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，適用于Her-2過度表達的胃癌。由于只有Her-2過度表達和基因擴增的胃癌患者用曲妥珠單抗治療才有效，因此正確檢測和評定胃癌的Her-2表達狀態至關重要。

目前通常使用的Her-2檢測方法有兩種。一種是免疫組織化學方法，通過檢測胃癌組織標本中的Her-2蛋白表達情況判定Her-2狀態。該方法被認為是Her-2檢測的金標準，但有研究證實該方法無法區分Her-2蛋白為中度陽性的患者是否存在Her-2基因的擴增。另外一種方法是基于檢測Her-2基因擴增水平的熒光原位雜交法(FISH)，特異性更高，目前臨床應用亦越來越多。這兩種檢測方法均是以腫瘤組織為檢測對象，而對于復發或轉移無法獲取組織標本的胃癌，Her-2狀態評估變得困難。

發明內容

循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

為了克服無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌患者無法檢測Her-2表達，進而不能評估患者Her-2狀態的不足，本發明提供了一種胃癌患者外周血Her-2基因的檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，進而檢測無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌外周血CTC的Her-2表達情況。

本發明采用的技術方案如下：

一、利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的晚期或復發胃癌患者外周血中的CTC：

1、采集無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌患者外周血：自肘正中靜脈采集空腹8-12小時的空腹血5ml；

2、外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25％；

3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

4、過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入B液，1ml，染色2min，純水1ml,沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC。

二、運用細胞蠟塊技術制作薄層切片：

1、脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按容積比1:1混勻。

2、包裹：浸泡結束后取出濾膜，用顯微鏡擦鏡紙或濾紙包裹；

3、固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4、浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細胞石蠟塊；

5、薄層切片：用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μm的薄層切片。

三、檢測無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌外周血CTC的Her-2表達情況：