[發明專利]一種胃癌患者外周血循環腫瘤細胞Her?2基因的檢測方法

有效

• 申請號: 201610058495.2
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105588943B
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 陸信仰;李勝;仇紅;王愛亮;王振丹
• 申請（專利權）人: 山東省腫瘤防治研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司37105
• 代理人: 黎明

1.一種胃癌患者外周血循環腫瘤細胞Her-2基因非診斷目的的檢測方法，其特征在于，所述方法為：利用膜過濾裝置分離獲取晚期或復發胃癌患者外周血中的CTC，運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，檢測晚期或復發胃癌外周血CTC的Her-2表達情況；

所述的利用膜過濾裝置分離獲取晚期或復發胃癌患者外周血中的CTC，其方法步驟如下：

1)采集無法獲取組織標本的晚期或復發胃癌患者外周血：自肘正中靜脈采集空腹8-12小時的空腹血5ml；

2)外周血樣預處理：將采集的外周血樣按1：10濃度稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25％；

3)利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器(2)中，使其依靠重力自然過濾；

4)過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器(3)，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器(3)中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入B液，1ml，染色2min，純水1ml,沖洗2次，取下濾膜(7)，放置在載玻片上，室溫放置，濾膜干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

所述的運用細胞蠟塊技術制作薄層切片，方法如下：

1)脫色：將帶有CTC的濾膜(7)從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按容積比1:1混勻；

2)包裹：浸泡結束后取出濾膜(7)，用顯微鏡擦鏡紙或濾紙包裹；

3)固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4)浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細胞石蠟塊；

5)薄層切片：用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μm的薄層切片；

所述的檢測晚期或復發胃癌外周血CTC的Her-2表達情況，其方法步驟如下：

1)CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分鐘；無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘；95％乙醇溶液浸泡5分鐘；85％乙醇溶液浸泡5分鐘；75％乙醇溶液浸泡5分鐘；蒸餾水浸泡2次，每次3分鐘；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分鐘；

2)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復法對組織抗原進行修復：取pH＝6.0檸檬酸鹽緩沖液800-1500ml于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫不銹鋼切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，鍋蓋繼續加熱至噴汽開始計時，噴汽1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用pH＝7.2～7.4的PBS沖洗兩次，每次3分鐘；

3)3％H2O2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

4)滴加Her-2一抗，室溫或37℃孵育1～2小時或4℃過夜，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

5)滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次，每次2分鐘；

6)應用DAB溶液顯色：甩去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；

7)蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明封片：蒸餾水沖洗2次，每次3分鐘；蘇木素復染1分鐘；0.1％鹽酸酒精分化；0.1％氨水溶液返藍；50％、70％、85％、95％梯度無水乙醇脫水干燥；二甲苯透明，中性樹脂膠封片；

8)細胞病理學專家閱片，根據細胞膜和細胞漿著色程度判定Her-2表達情況。

2.根據權利要求1所述的胃癌患者外周血循環腫瘤細胞Her-2基因非診斷目的的檢測方法，其特征在于，所述的膜過濾裝置包括濾器(3)、血樣容器(2)、廢液缸(5)和鐵架臺(1)，所述鐵架臺(1)設有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血樣容器(2)通過支架(13)設置于鐵架臺(1)上部，血樣容器(2)的下方為濾器(3)，濾器(3)通過輸液器(4)聯通至廢液缸(5)，廢液缸(5)設置于底座(11)上。