[發(fā)明專利]一種支持單啟動子帶動多個不同基因表達的載體構建方法

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• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105524937A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 張慶玲;馬文霞
• 申請（專利權）人: 南方醫(yī)科大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 朗堅

技術領域

本發(fā)明涉及一種生物載體構建方法，具體涉及一種支持單啟動子帶動多個不同基因表達的載體構建方法。

背景技術

表達載體的構建是生物工程技術最常用的技術方法，是實現(xiàn)基因表達調控、進而研究基因功能的實踐基礎。生物體內，基因經(jīng)過翻譯后表達蛋白質是其發(fā)揮作用最主要形式之一，而蛋白質通常會形成一個相互作用蛋白網(wǎng)絡進而在“信息網(wǎng)”內受到不同外界環(huán)境的調節(jié)，進而通過不同的蛋白partner，發(fā)揮相應的作用。研究兩種甚至多種蛋白質之間的相互作用關系是目前基因蛋白質組學的主要研究方向之一。目前為止，對實現(xiàn)在同一個細胞個體內兩種基因蛋白質的調控，主要是采用分別轉染各自的表達載體，但是真核表達載體本身具有一定長度，當有多個待研究基因時，多個表達載體長度會對細胞造成極大負擔，降低表達效率，而且采用多個獨立的表達載體，待研究基因是否能有效的實現(xiàn)同時表達，也是對研究課題的一大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內容

為解決這些問題，我們設計了一種新的基因工程技術，旨在實現(xiàn)在同一個真核表達載體內同時表達兩個甚至多個基因。而且操作過程簡單方便，只需要經(jīng)過兩次不同的PCR循環(huán)。

本發(fā)明提供了一種支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以PCR方法擴增以共同過渡片段連接的兩個以上目標基因序列，獲得包含兩個以上目標基因序列的DNA片段；

2)將步驟1)所得DNA片段純化；

3)雙酶切步驟2)獲得的反應產(chǎn)物及真核載體骨架；

4)將步驟3)內反應產(chǎn)物與載體骨架進行連接；

5)將步驟4)所得連接產(chǎn)物轉化入載體中；

其中，步驟1)的PCR方法是包括兩個步驟；

1a)分別用F1與R1、F2與R2、……Fn與Rn為引物，分別擴增第1基因、第2基因、……第n基因，對不同的目標序列進行分別擴增，

1b)以F1和Rn分別為上下游引物，以步驟1a)PCR擴增產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR擴增，

其中，所述共同過渡片段為上下游目標基因序列的終止密碼子-人基因非同源無義過渡序列-下游目標基因序列的起始密碼子；

R1為人基因非同源無義過渡序列的反義序列-第1基因終止密碼子-第1基因特異性引物序列、Rn-1為人基因非同源無義過渡序列的反義序列-第n-1基因終止密碼子-第n-1基因特異性引物序列；

F2為人基因非同源無義過渡序列-第2基因起始密碼子-第2基因特異性引物序列、Fn為人基因非同源無義過渡序列-第n基因起始密碼子-第n基因特異性引物序列。

進一步地，n為小于或等于10的整數(shù)，優(yōu)選地，n為2、3、4、5、6、7、8、9或10。

進一步地，不同目標基因中的人基因非同源無義過渡序列為相同序列或者不同序列。

進一步地，人基因非同源無義過渡序列的長度為3的倍數(shù)個堿基，優(yōu)選為3-30個堿基，優(yōu)選為6-12個堿基。

進一步地，F(xiàn)1中包含上游酶切位點，Rn中包含下游酶切位點。

進一步地，F(xiàn)1為保護堿基-酶切位點-KOZAK序列-第1基因的特異性序列。

進一步地，Rn為保護堿基-酶切位點-第n基因的特異性序列。

進一步地，1b)中使用的作為模板1a)所得的各個PCR擴增產(chǎn)物比例相同。

進一步地，步驟4中步驟3所得酶切后的載體骨架：DNA片段的摩爾比＝1：5～1:10。

如附圖2，以待研究基因為A基因、B基因為例，分別設計A基因與B基因的待研究位點PCR擴增引物，A基因的上游引物F1，B基因的下游引物R2常規(guī)設計。在A基因下游引物設計時，在引物序列前段加附內xxxx片段，引物設計公式如例圖。同理，B基因的上游引物序列如例圖設計。引物合成后，

首次PCR循環(huán)：

分別用F1與R1以及F2與R2為引物，同時擴增A基因與B基因，實現(xiàn)在兩個基因擴增產(chǎn)物之間插入“xxxx”這個共同過渡片段；

第二次PCR循環(huán)：

以F1、R2分別為上下游引物，以第一次PCR擴增產(chǎn)物為模板進行PCR，實現(xiàn)對A、B基因的融合。所有PCR擴增為常規(guī)條件。后續(xù)進行載體與基因片段連接常規(guī)步驟：根據(jù)真核表達載體骨架MCS區(qū)，選擇合適的酶切位點，同時雙酶切載體骨架與第二次循環(huán)產(chǎn)物，后進行產(chǎn)物T4連接酶連接。完成載體構建，測序檢驗有效性。