[發明專利]一種支持單啟動子帶動多個不同基因表達的載體構建方法

在審

• 申請號: 201610057505.0
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105524937A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 張慶玲;馬文霞
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 朗堅

1.一種支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構建方法，其特征在于，包括 以下步驟：

1)以PCR方法擴增以共同過渡片段連接的兩個以上目標基因序列，獲得包含 兩個以上目標基因序列的DNA片段；

2)將步驟1)所得DNA片段純化；

3)雙酶切步驟2)獲得的反應產物及真核載體骨架；

4)將步驟3)內反應產物與載體骨架進行連接；

5)將步驟4)所得連接產物轉化入載體中；

其中，步驟1)的PCR方法包括兩個步驟；

1a)分別用F1與R1、F2與R2、……Fn與Rn為引物，分別擴增第1基因、 第2基因、……第n基因，對不同的目標序列進行分別擴增，

1b)以F1和Rn分別為上下游引物，以步驟1a)PCR擴增產物為模板進行第 二輪PCR擴增，

其中，所述共同過渡片段為上下游目標基因序列的終止密碼子-人基因非同源 無義過渡序列-下游目標基因序列的起始密碼子；

R1為人基因非同源無義過渡序列的反義序列-第1基因終止密碼子-第1基因 特異性引物序列、Rn-1為人基因非同源無義過渡序列的反義序列-第n-1基因終止 密碼子-第n-1基因特異性引物序列；

F2為人基因非同源無義過渡序列-第2基因起始密碼子-第2基因特異性引物 序列、Fn為人基因非同源無義過渡序列-第n基因起始密碼子-第n基因特異性引 物序列。

2.根據權利要求1所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構建方法， n為小于或等于10的整數，優選地，n為2、3、4、5、6、7、8、9或10。

3.根據權利要求1-2任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，不同目標基因中的人基因非同源無義過渡序列為相同序列或者不同序列。

4.根據權利要求1-3任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，人基因非同源無義過渡序列的長度為3的倍數個堿基，優選為3-27個堿 基，更優選6-12個堿基。

5.根據權利要求1-4任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，F1中包含上游酶切位點，Rn中包含下游酶切位點。

6.根據權利要求1-5任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，F1為保護堿基-酶切位點-KOZAK序列-第1基因的特異性序列。

7.根據權利要求1-6任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，Rn為保護堿基-酶切位點-第n基因的特異性序列。

8.根據權利要求1-7任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，1b)中使用的作為模板1a)所得的各個PCR擴增產物比例相同。

9.根據權利要求1-8任一項所述的支持單啟動子帶動多個基因表達的載體構 建方法，步驟4中步驟3所得酶切后的載體骨架：DNA片段的摩爾比＝1：5～1:10。