[發明專利]一種五肽的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610057320.X
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105541968B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 林志隆
• 申請（專利權）人: 安婕妤化妝品科技股份有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/06;A61K8/64;A61Q19/08
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種五肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)CbzLys的制備：在反應瓶中依次加入鹽酸賴氨酸、水和堿式碳酸銅，攪拌回流反應3～5h，再加入60℃～70℃的熱水，過濾，濾液恒溫0℃，用固體Na₂CO₃調節pH值至9，滴加氯甲酸芐酯，同時用固體Na₂CO₃控制pH≈9，滴加完后室溫反應10～15h，過濾得到藍色固體；在藍色固體中加入水，邊攪拌邊通入H₂S，40～60℃反應2～4h，用2mol/L的鹽酸調節pH值至2～3，煮沸5～10min，過濾，濃縮濾液，放在冰箱中0～4℃過夜結晶，過濾，干燥，得到結構式如下的CbzLys：所述鹽酸賴氨酸、水、堿式碳酸銅、氯甲酸芐酯、H₂S的摩爾比為1：(10～20)：(1～1.3)：(1.05～1.3)：(0.5～1)；

2)CbzLysBoc的制備：將CbzLys用二氧六環和NaOH溶液溶解，恒溫0℃，滴加(Boc)₂O，滴加完后反應20～25h，濃縮反應液，加入乙酸乙酯洗滌，除去剩余的(Boc)₂O，用稀磷酸調節pH值至4～5，用飽和NaCl溶液洗滌，乙酸乙酯萃取，萃取液用無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的CbzLysBoc：所述CbzLys、(Boc)₂O的摩爾比為1：(1.05～1.5)；所述CbzLys、二氧六環的質量體積比為1g：(10～15)mL；所述二氧六環和NaOH溶液的體積比為1：(1～2)；

3)CbzLysBoc-SerOMe的制備：將CbzLysBoc和L-絲氨酸甲酯鹽酸鹽加入反應瓶，加入無水四氫呋喃，再加入HOBt和DCC，恒溫0℃，滴加DIPEA，滴加完后室溫充分反應，再分別用稀磷酸溶液、飽和Na₂CO₃溶液、飽和NaCl溶液洗滌，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的CbzLysBoc-SerOMe：所述CbzLysBoc、L-絲氨酸甲酯鹽酸鹽、HOBt、DCC、DIPEA的摩爾比為1：(1.2～1.5)：(1.0～1.3)：(1.0～1.3)：(2.0～2.3)；所述CbzLysBoc、無水四氫呋喃的質量體積比為1g：(10～15)mL；

4)CbzLys-SerOMe的制備：將CbzLysBoc-SerOMe溶于鹽酸乙酸乙酯溶液，充分反應，脫去Boc保護基，析出沉淀，過濾，得到結構式如下的CbzLys-SerOMe：所述CbzLysBoc-SerOMe、鹽酸乙酸乙酯溶液的質量體積比為1g：(5～15)mL；所述鹽酸乙酸乙酯溶液的物質的量濃度為2～4mol/L；

5)Boc₂Lys的制備：將鹽酸賴氨酸溶于水，恒溫0℃，滴加1mol/L的NaOH溶液，加入四氫呋喃，再滴加(Boc)₂O的四氫呋喃溶液，滴加完后室溫攪拌至反應完全，減壓蒸餾除去四氫呋喃，再用乙酸乙酯萃取，冰浴下用檸檬酸溶液調節pH值至3～4，用乙酸乙酯萃取3～4次，萃取液用飽和氯化鈉洗滌，無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，干燥，得到結構式如下的Boc₂Lys：所述鹽酸賴氨酸、(Boc)₂O的摩爾比為1：(1.05～1.2)；所述鹽酸賴氨酸、NaOH溶液的質量體積比為1g：(3～5)mL；所述水、NaOH溶液、四氫呋喃、(Boc)₂O的四氫呋喃溶液的體積比為1：(0.1～0.2)：(0.1～0.2)：(0.1～0.2)；所述(Boc)₂O的四氫呋喃溶液中(Boc)₂O的物質的量濃度為1～3mol/L；

6)Boc₂Lys-ThrOMe的制備：將Boc₂Lys和HOBt溶于THF，恒溫0℃，加入DCC，恒溫反應3～5h，過濾除去沉淀得濾液，將含L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽和三乙胺的DMF溶液慢慢加入上述濾液中，室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾除去溶劑DMF和THF，再加入碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯，萃取4～5次，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Boc₂Lys-ThrOMe：所述Boc₂Lys、HOBt、DCC、L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽、三乙胺的摩爾比為1：(1.05～1.3)：(1.05～1.2)：(1.05～1.2)：(1.05～1.1)；所述Boc₂Lys、THF的質量體積比為1g：(25～30)mL；所述THF、DMF的體積比為1：(0.2～0.6)；

7)Boc₂Lys-Thr的制備：將Boc₂Lys-ThrOMe和乙醇加入反應釜，恒溫0℃，滴加9.6mol/L的氫氧化鈉溶液，滴加完后反應1～2h，減壓蒸餾蒸干溶劑，用乙醇洗滌，過濾，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Boc₂Lys-Thr：所述Boc₂Lys-ThrOMe、乙醇的質量體積比為1g：(10～20)mL；所述乙醇、氫氧化鈉溶液的體積比為1：(0.25～0.5)；

8)Boc₂Lys-Thr-ThrOMe的制備：將Boc₂Lys-Thr和HOBt溶于THF，恒溫0℃，加入DCC，恒溫反應3～5h，過濾除去沉淀得濾液，將含L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽和三乙胺的DMF 溶液慢慢加入上述濾液中，室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾除去溶劑DMF和THF，加入碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯，萃取3～5次，用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Boc₂Lys-Thr-ThrOMe：所述Boc₂Lys-Thr、HOBt、DCC、L-ThrOMe、三乙胺的摩爾比為1：(1.05～1.3)：(1.05～1.2)：(1.05～1.2)：(1.0～1.3)；所述Boc₂Lys-Thr、THF的質量體積比為1g：(10～20)mL；所述THF、DMF的體積比為1：(0.2～0.6)；

9)Boc₂Lys-Thr-Thr的制備：將Boc₂Lys-Thr-ThrOMe和乙醇加入反應釜，恒溫0℃，滴加9.6mol/L的氫氧化鈉溶液，滴加完后恒溫反應1～2h，減壓蒸餾蒸干溶劑，用乙醇溶解洗滌，過濾，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Boc₂Lys-Thr-Thr：

所述Boc₂Lys-Thr-ThrOMe、乙醇的質量體積比為1g：(10～20)mL；所述乙醇、氫氧化鈉溶液的體積比為1：(0.25～0.5)；

10)Boc₂Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe的制備：將Boc₂Lys-Thr-Thr和HOBt溶于THF，恒溫0℃，加入DCC，恒溫反應3～5h，過濾沉淀得濾液，將含CbzLys-SerOMe和三乙胺的DMF溶液緩慢加入上述濾液中，室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾除去THF和DMF，加入碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯，萃取3～5次，用飽和氯化鈉溶液洗，無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Boc₂Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe：所述Boc₂Lys-Thr-Thr、HOBt、DCC、CbzLys-SerOMe、三乙胺的摩爾比為1：(1.05～1.3)：(1.05～1.2)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)；所述Boc₂Lys-Thr-Thr、THF的質量體積比為1g：(15～20)mL；所述CbzLys-SerOMe和三乙胺的DMF溶液中CbzLys-SerOMe的物質的量濃度為0.5～2mol/L；所述THF、DMF的體積比為1：(0.2～0.6)；

11)Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe的制備：將Boc₂Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe溶于鹽酸乙酸乙酯溶液，25～40℃反應10～16h，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe：所述Boc₂Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe、鹽酸乙酸乙酯溶液的質量體積比為1g：(20～30)mL；所述鹽酸乙酸乙酯溶液的物質的量濃度為2～4mol/L；

12)Lys-Thr-Thr-CbzLys-Ser的制備：將Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe和乙醇加入反應釜，恒溫0℃，滴加9.6mol/L的氫氧化鈉溶液，滴加完后恒溫反應1～2h，減壓蒸餾蒸干溶劑，用乙醇洗滌，過濾，減壓蒸餾蒸干溶劑，得到結構式如下的Lys-Thr-Thr-CbzLys-Ser：所述Lys-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe、乙醇的質量體積比為3g：(20～30)mL；所述乙醇、氫氧化鈉溶液的體積比為1：(0.25～0.5)；

13)水溶性五肽Lys-Thr-Thr-Lys-Ser的制備：將Lys-Thr-Thr-CbzLys-Ser溶于乙醇和水的混合溶液，加入鈀碳，充入氫氣，25～40℃攪拌過夜，過濾除去濾渣，減壓蒸餾，再加入乙醇，析出白色沉淀，過濾，干燥，得到結構式如下的終產物五肽Lys-Thr-Thr-Lys-Ser：所述Lys-Thr-Thr-CbzLys-Ser、乙醇和水的混合溶液的質量體積比為1g：(10～25)mL；所述乙醇和水的混合溶液中乙醇、水的體積比為1：(1～2)；所述Lys-Thr-Thr-CbzLys-Ser、鈀碳的質量比為1：(0.06～0.125)；

或者，包括以下步驟：

1)棕櫚酰氯的制備：將SOCl₂加入反應釜，恒溫0℃，加入棕櫚酸，攪拌30～50min，恒溫60℃回流反應2～3h，蒸餾回收溶劑SOCl₂，加丙酮蒸干得到棕櫚酰氯；所述棕櫚酸、SOCl₂的質量體積比為1g：(10～15)mL；

2)PalLysCbz的制備：將CbzLys溶于1mol/L的NaOH溶液，恒溫0℃，慢慢加入棕櫚酰氯，室溫反應3～5h，過濾除去沉淀得到濾液，用稀磷酸溶液調節pH值至2～3，析出白色沉淀，過濾，用稀磷酸溶液洗滌沉淀3～5次，干燥，用CH₂Cl₂重結晶，得到結構式如下的PalLysCbz：所述CbzLys、棕櫚酰氯的摩爾比為1:(1～1.3)；所述CbzLys、NaOH溶液的質量體積比為1g：(5～10)mL；

3)蘇氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：將L-蘇氨酸和甲醇加入反應釜，恒溫0℃，滴加SOCl₂，滴加完后室溫反應20～30h，減壓蒸餾除去CH₃OH和SOCl₂，得到蘇氨酸甲酯鹽酸鹽；所述L-蘇氨酸、甲醇的質量體積比為1g:(10～20)mL；所述L-蘇氨酸、SOCl₂的摩爾比為1:(1.1～1.5)；

4)PalLysCbz-ThrOMe的制備：將蘇氨酸甲酯鹽酸鹽、PalLysCbz、HOBt和DCC加入反應瓶，恒溫0℃，加入四氫呋喃，滴加DIPEA，滴加完后室溫充分反應，分別用稀磷酸溶液、飽和Na₂CO₃溶液、飽和NaCl溶液洗滌，二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，得到結構式如下的PalLysCbz-ThrOMe：所述蘇氨酸甲酯鹽酸鹽、PalLysCbz、HOBt、DCC、DIPEA的摩爾比為1:(0.9～1.0)：(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：(1.0～2.5)；所述蘇氨酸甲酯鹽酸鹽、四氫呋喃的質量體積比為1g：(15～30)mL；

5)PalLysCbz-Thr的制備：將PalLysCbz-ThrOMe溶于DMF，滴加1mol/L的NaOH溶液，水解3～5h脫去酯基，用磷酸調節pH值至4～5，過濾，沉淀經洗滌、干燥，得到結構式如下的PalLysCbz-Thr：所述PalLysCbz-ThrOMe、DMF的質量體積比為1g：(3～15)mL；所述DMF、NaOH溶液的體積比為1：(1.0～1.5)；

6)PalLysCbz-Thr-Thr-OMe的制備：將PalLysCbz-Thr和L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽溶于DMF，再加入HOBt和DCC，恒溫0℃，滴加DIPEA，滴加完后室溫充分反應，再分別用稀磷酸溶液、飽和Na₂CO₃溶液、飽和NaCl溶液洗滌，乙酸乙酯萃取，減壓蒸餾，得到結構式如下的PalLysCbz-Thr-Thr-OMe：

所述PalLysCbz-Thr、L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽、HOBt、DCC、DIPEA的摩爾比為1：(0.9～1.0)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)；所述PalLysCbz-Thr、DMF的質量體積比為1g：(15～20)mL；

7)PalLysCbz-Thr-Thr的制備：將PalLysCbz-Thr-Thr-OMe溶于LiOH、水和DMF的混合溶液，水解脫去酯基，用磷酸調節pH值至3，過濾，沉淀經洗滌、干燥，得到結構式如下的PalLysCbz-Thr-Thr：所述PalLysCbz-Thr-Thr-OMe、LiOH的摩爾比為1：(1.0～1.2)；水和DMF的體積比為1：(1.0～1.2)；LiOH在混合溶液中的物質的量濃度為1～2mol/L；

8)PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe的制備：將PalLysCbz-Thr-Thr和CbzLys-SerOMe溶于DMF，再加入HOBt和DCC，恒溫0℃，緩慢滴加DIPEA，滴加完后室溫反應20～30h，分別用稀磷酸溶液、飽和Na₂CO₃溶液和飽和NaCl溶液各洗滌3～5次，用二氯甲烷萃取，合并有機相，用無水Na₂SO₄干燥，減壓蒸餾，得到結構式如下的PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe：所述PalLysCbz-Thr-Thr和CbzLys-SerOMe、HOBt、DCC、DIPEA的摩爾比為1：(0.9～1.0)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)；所述PalLysCbz-Thr-Thr、DMF的質量體積比為1g：(15～20)mL；

9)PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-Ser的制備：將PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe溶解于LiOH、水和DMF的混合溶液，水解8～10h脫去酯基，調節pH值至3～4、過濾、用水洗滌、干燥，得到結構式如下的PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-Ser：所述PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-SerOMe、LiOH的摩爾比為1：(1.0～1.2)；所述水和DMF的體積比為1：(1.0～1.2)；所述LiOH在混合溶液中的物質的量濃度為1～2mol/L；

10)終產物油溶性五肽的制備：將PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-Ser溶于乙醇和水的混合溶液，加入鈀碳催化劑，充入氫氣，經催化加氫脫去芐氧羰基，得到結構式如下的終產物油溶性五肽：所述PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-Ser、乙醇和水的混合溶液的質量體積比為1g：(10～25)mL；所述乙醇和水的混合溶液中乙醇、水的體積比為1：(1～2)；所述PalLysCbz-Thr-Thr-CbzLys-Ser、鈀碳的質量比為1：(0.08～0.50)。