[發明專利]一種四肽的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610057317.8
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105541966B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 林志隆
• 申請（專利權）人: 安婕妤化妝品科技股份有限公司
• 主分類號: C07K5/103
• 分類號: C07K5/103;C07K1/06;A61K8/64;A61Q19/08;A61Q17/00;A61Q19/00
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種四肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)硝基精氨酸的制備：將發煙硝酸和濃硫酸混合均勻，置于冰鹽浴中，邊攪拌邊緩慢加入L-精氨酸，攪拌反應2～3h，再加入濃氨水調節pH值至8～9，然后用冰醋酸調節pH值到6，將反應液置于冰箱中0～4℃保存4～6h，收集沉淀物，沉淀分別經水洗1～2h、95％的乙醇洗1～2h、抽濾、干燥，得到結構式如(1)所示的硝基精氨酸，所述L-精氨酸、發煙硝酸的質量體積比為1g：(1.25～2)mL；所述發煙硝酸、濃硫酸的體積比為1：(0.4～1)；

2)硝基精氨酸甲酯的制備：將步驟1)的硝基精氨酸溶于甲醇，加入DMF，置于冰鹽浴中，滴加SOCl₂，滴加完后反應30～50min，然后慢慢升溫至75～85℃，回流反應6～8h，反應液經減壓蒸餾除去溶劑、乙醇結晶，得到結構式如(2)所示的硝基精氨酸甲酯，所述硝基精氨酸、甲醇的質量體積比為1g：(3～15)mL；所述硝基精氨酸、DMF的摩爾比為1：(0.01～0.05)；所述硝基精氨酸、SOCl₂的摩爾比為1：(1～1.6)；

3)BocPro的制備：將脯氨酸溶于水，置于冰鹽浴中，滴加NaOH溶液，再加入THF，再滴加含(Boc)₂O的THF溶液，滴加完后室溫攪拌至反應完全，減壓蒸餾除去THF，用石油醚萃取除去未反應的(Boc)₂O，再置于冰鹽浴中用檸檬酸溶液調節pH值至2～3，析出沉淀，抽濾，得白色固體，濾液用乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液經飽和氯化鈉洗滌、無水Na₂SO₄干燥、減壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到結構式如(3)所示的BocPro，所述脯氨酸、水的質量體積比為1g：(50～80)mL；所述水、NaOH溶液、THF、含(Boc)₂O的THF溶液的體積比為6：(3～4)：(3～4)：(3～4)；所述NaOH溶液的物質的量濃度為1～3mol/L；所述脯氨酸、(Boc)₂O的摩爾比為1：(1.1～1.5)；

4)BocPro-NO₂ArgOMe的制備：將含BocPro、縮合劑的THF溶液置于冰鹽浴中，加入脫水劑，恒溫反應3～5h，將生成的沉淀過濾得濾液，再將含硝基精氨酸甲酯、三乙胺的DMF溶液慢慢加入到上述反應體系中，于室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾除去DMF和THF，加入碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯萃取5～6次，萃取液經飽和氯化鈉溶液洗滌、硫酸鈉干燥、減壓蒸餾，得到結構式如(4)所示的BocPro-NO₂ArgOMe，所述BocPro、縮合劑、脫水劑、硝基精氨酸甲酯、三乙胺的摩爾比為1：(1.1～1.4)：(1.1～1.3)：(1～1.2)：(1～1.2)；所述THF溶液、DMF溶液的體積比為(2～3)：1；所述縮合劑為N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑中的一種；所述脫水劑為碳化二亞胺類；

5)Pro-NO₂ArgOMe的制備：將BocPro-NO₂ArgOMe溶于鹽酸乙酸乙酯溶液，40～50℃反應過夜，過濾，干燥，得到結構式如(5)所示的Pro-NO₂ArgOMe，所述BocPro-NO₂ArgOMe、鹽酸乙酸乙酯溶液的質量體積比為1g：(10～40)mL；所述鹽酸乙酸乙酯溶液的物質的量濃度為2～4mol/L；

6)BocGly的制備：將甘氨酸水溶液置于冰鹽浴中，滴加NaOH溶液，加入THF，滴加(Boc)₂O的THF溶液，維持pH值為8～10，滴完后室溫攪拌反應2～4h，減壓蒸餾除去THF，再置于冰鹽浴中用檸檬酸溶液調節pH至1～3，再用乙酸乙酯萃取3～4次，萃取液經飽和氯化鈉洗滌、無水Na₂SO₄干燥、減壓蒸餾，得到結構式如(6)所示的BocGly，所述甘氨酸水溶液中甘氨酸、水的質量體積比為1g：(15～30)mL；所述甘氨酸水溶液、NaOH溶液、THF、(Boc)₂O的THF溶液的體積比為20：(5～8)：(5～8)：(3～5)；所述NaOH溶液的物質的量濃度為1～3mol/L；

7)BocGly-Gln的制備：將含BocGly和縮合劑的THF溶液置于冰鹽浴中，加入脫水劑，恒溫反應5～7h，將生成的沉淀過濾得濾液，將濾液滴加到含谷氨酰胺和NaHCO₃的水溶液中，室溫攪拌反應過夜，調節pH值到6，減壓蒸餾除去THF，用乙酸乙酯萃取除去小極性雜質，再調節pH值到3～4，將反應液置于冰箱中0～4℃過夜，結晶析出白色沉淀，沉淀經過濾、干燥，得到結構式如(7)所示的BocGly-Gln，所述含BocGly和縮合劑的THF溶液、含Gln和NaHCO₃的水溶液的體積比為3：(2～4)；所述BocGly、縮合劑、脫水劑、谷氨酰胺、NaHCO₃的摩爾比為1：(1～1.3)：(1～1.3)：(1～1.2)：(1.3～1.6)；所述縮合劑為N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑中的一種；所述脫水劑為碳化二亞胺類；

8)BocGly-Gln-Pro-NO₂ArgOMe的制備：將含BocGly-Gln和縮合劑的THF溶液置于冰鹽浴中，加入脫水劑，恒溫反應5～7h，將生成的沉淀過濾得濾液，將濾液滴加到含Pro-NO₂ArgOMe和三乙胺的DMF溶液中，滴加完后室溫攪拌反應過夜，減壓蒸餾除去THF，用碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液經碳酸氫鈉洗滌、5％的乙酸溶液洗滌、飽和氯化鈉溶液洗滌、硫酸鈉干燥、減壓蒸餾、二氯甲烷重結晶，得到結構式如(8)所示的BocGly-Gln-Pro-NO₂ArgOMe，所述BocGly-Gln、縮合劑、脫水劑、Pro-NO₂ArgOMe、三乙胺的摩爾比為1：(1.1～1.3)：(1～1.3)：(1.0～1.2)：(1.0～1.5)；所述THF溶液、DMF溶液的體積比為1：(0.2～0.4)；所述縮合劑為N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑中的一種；所述脫水劑為碳化二亞胺類；

9)BocGly-Gln-Pro-NO₂Arg的制備：將BocGly-Gln-Pro-NO₂ArgOMe的乙醇溶液置于冰鹽浴中，滴加NaOH溶液，滴加完后恒溫反應1～2h，減壓蒸餾，用乙醇溶解打漿，過濾除去固體雜質，減壓蒸餾，得到結構式如(9)所示的BocGly-Gln-Pro-NO₂Arg，所述BocGly-Gln-Pro-NO₂ArgOMe的乙醇溶液中BocGly-Gln-Pro-NO₂ArgOMe、乙醇的質量體積比為1g：(5～10)mL；所述乙醇溶液、NaOH溶液的體積比為20：(3～6)；所述NaOH溶液的物質的量濃度為1～2mol/L；

10)Gly-Gln-Pro-NO₂Arg的制備：將BocGly-Gln-Pro-NO₂Arg溶于鹽酸乙酸乙酯溶液，室溫下攪拌反應，析出固體，過濾，得到結構式如(10)所示的Gly-Gln-Pro-NO₂Arg，所述BocGly-Gln-Pro-NO₂Arg、鹽酸乙酸乙酯溶液的質量體積比為1g：(10～25)mL；所述鹽酸乙酸乙酯溶液的物質的量濃度為2～4mol/L；

11)終產物四肽Gly-Gln-Pro-Arg的制備：將Gly-Gln-Pro-NO₂Arg溶于乙醇和水的混合溶液，加入鈀碳，充入氫氣，25～40℃攪拌過夜，過濾除去濾渣，減壓蒸餾，再加入乙醇，析出白色沉淀，過濾，干燥，得到結構式如(11)所示的四肽Gly-Gln-Pro-Arg，所述Gly-Gln-Pro-NO₂Arg、乙醇和水的混合溶液的質量體積比為1g：(10～25)mL；所述乙醇和水的混合溶液中乙醇、水的體積比為1：(1～2)；所述Gly-Gln-Pro-NO₂Arg、鈀碳的質量比為1：(0.06～0.125)。