[發明專利]一種用于NK細胞體外擴增的培養基及NK細胞體外擴增的方法

在審

• 申請號: 201610056712.4
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105567634A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 劉軍;唐歡
• 申請（專利權）人: 上海潤泉生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

技術領域

本發明涉及免疫學領域，具體涉及一種用于NK細胞體外擴增的培養基及 NK細胞體外擴增的方法。

背景技術

自然殺傷細胞(Naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，在抗腫瘤 和抗病毒感染免疫中起著重要作用。由于NK細胞殺傷活性無MHC限值，因此 稱為自然殺傷細胞。NK細胞的靶細胞主要是腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自 身組織細胞(如血細胞)及寄生蟲等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染免 疫的重要組成部分。由于這些特點，NK細胞在細胞免疫治療上有著廣泛的應用 前景。在體外被活化的NK細胞毒性較高，可用作免疫細胞的治療制劑。人體 體外及動物試驗證實了其對各種癌癥治療的可能性：利用腫瘤細胞系的方法， 確認其對血液系統腫瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、腎癌、神經系統腫 瘤和皮膚癌等均具有體外細胞毒性，特別是對白血病和神經源性腫瘤已明確了 其臨床及非臨床的治療效果。2009年，NK細胞治療技術就已列入國家三類醫 療技術目錄。

充足的細胞數量和強烈的細胞毒性是細胞治療療效提升的關鍵因素。由于 人外周血中NK細胞含量很少(約占淋巴細胞的5～10％)，從外周血中分離NK 細胞成本昂貴，而且分離的NK細胞一般都處于非活化狀態，在很大程度上限 制了其在臨床上應用。要達到治療效果，所需的有效NK細胞數量單一批次應 用至少要5×10⁹個(且純度達到80％以上)，目前有報道的采用無血清培養體系， 通過IL-2、IL-21及相關組合因子刺激培養均不能實現NK細胞的高活性、高純 度和高擴增倍數，其擴增能力最多達到300倍，臨床應用存在安全風險。通過 自體血清培養體系實現規模擴增，且獲得單一培養體系、單批次擴增的細胞數 量大于1×10¹⁰個NK細胞，且純度大于90％的未見報道。

CN102586185A公開了一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法，具體為 使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137轉染的K562細胞和低濃度白 介素2共同作用定向擴增激活自然殺傷細胞的方法，該發明是以K562細胞系轉 錄穩定表達CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表達載體，CD8α 為在細胞膜上表達的膜蛋白，CD8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表 達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；然后培養K562細胞一段時間，最后經物理、化 學方式得到純化的K562細胞，再對NK細胞進行培養。CN102268405B公開 了一種自體NK細胞體外活化擴增培養的方法及其專用培養基。該方法是利用 如下成套培養基并同時添加飼養細胞體外活化擴增自體NK細胞：由培養基1、 培養基2和培養基3組成的成套培養基；所述培養基1是在干細胞生長培養基 中添加人白細胞介素2、人白細胞介素12、人白細胞介素15、人白細胞介素18、 植物血凝素、抗人T細胞CD3單克隆抗體和離體的人血漿得到的液體培養基； 所述培養基2與所述培養基1相比，所述培養基2中無所述植物血凝素和所述 抗人T細胞CD3單克隆抗體，其它成分均與所述培養基1的相同；所述培養基 3與所述培養基2相比，所述培養基3將所述培養基2中的所述離體的人血漿替 換為離體的人AB血清，其它成分均與所述培養基2的相同。CN103849599A 公開了一種高效擴增自體NK細胞的培養基及培養方法。所述培養基內含有白 細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介 素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和抗CD3抗體，可以高效擴增和活化 NK細胞，從而獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫 瘤、抗病毒感染和免疫調節相關疾病的治療中具有顯著療效。根據本發明的高 效擴增自體NK細胞的培養基及培養方法，其由細胞培養用培養基和添加于所 述細胞培養用培養基的添加因子構成，用于大量培養擴增自體活化的NK細胞， 其特征在于，所述添加因子包含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、 白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和抗 CD3抗體。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種殺傷能力大于90％的新型的用于NK細胞 體外擴增的培養基及NK細胞體外擴增的方法；

本發明的目的之二在于提供一種培養規模達到20L且可平行放大用于規模 化生產的用于NK細胞體外擴增的培養基及NK細胞體外擴增的方法；