[發(fā)明專利]一種用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)基及NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610056712.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN105567634A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉軍;唐歡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海潤(rùn)泉生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

1.一種用于NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的培養(yǎng)基，其特征在于，按體積百分含量包 括如下組分：淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基100％或RPMI1640培養(yǎng)基1～90％和淋巴細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基10～99％的混合物，以及血清替代物和白介素2；

其中，所述血清替代物的濃度為0.5～4g/L，所述白介素2的濃度為 50～500μg/mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，按體積百分含量包括如下 組分：淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基：40～50％和RPMI1640培養(yǎng)基：50～60％，以及血 清替代物和白介素2；

優(yōu)選地，所述血清替代物的濃度為1～3g/L；

優(yōu)選地，所述白介素2的濃度為200～300μg/mL。

3.一種利用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基進(jìn)行NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法， 其特征在于，包括制備跨膜結(jié)合蛋白為白介素15或白介素21的K562細(xì)胞的 步驟，所述K562細(xì)胞包括引導(dǎo)肽、跨膜結(jié)合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白； 所述引導(dǎo)肽為非病毒引導(dǎo)肽；所述分子膜定位蛋白為CD4；所述膜蛋白為 CD137L、CD86、CD19和CD64的混合物；所述跨膜結(jié)合蛋白與膜蛋白的相應(yīng) 序列通過2A序列串聯(lián)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備所述跨膜結(jié)合蛋白為白介素15的K562細(xì)胞；

(2)將所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基、CD16單克隆抗體與外周血單個(gè)核細(xì)胞共培 養(yǎng)；任選地，

步驟(2’)：將所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基、CD16單克隆抗體、步驟(1)所述跨 膜結(jié)合蛋白為白介素15的K562細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)；

(3)在培養(yǎng)的后續(xù)過程中，添加所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基、CD16單克隆抗體 和步驟(1)所述跨膜結(jié)合蛋白為白介素15的K562細(xì)胞；

(4)離心，收集NK細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述CD16單克隆抗體的濃 度為20～40ng/mL；

優(yōu)選地，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞的個(gè)數(shù)為1.5～5.0×10⁷個(gè)；

優(yōu)選地，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞的密度為1.0～3.0×10⁶個(gè)/mL；

優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)合蛋白為白介素15的K562細(xì)胞密度為1.0～3.0×10⁶個(gè)/mL；

優(yōu)選地，所述跨膜結(jié)合蛋白為白介素15的K562細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞 的數(shù)量比為(1～5)：2，更優(yōu)選為2:1；

優(yōu)選地，所述共培養(yǎng)的溫度為35～40℃，更優(yōu)選為39℃；

優(yōu)選地，所述共培養(yǎng)時(shí)二氧化碳的水平為5～10％，更優(yōu)選為5％；

優(yōu)選地，所述共培養(yǎng)的儀器為二氧化碳培養(yǎng)箱。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備所述跨膜結(jié)合蛋白為白介素21的K562細(xì)胞；

(2)將所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基與外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)；任選地，

步驟(2’)：將所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基、步驟(1’)所述跨膜結(jié)合蛋白為白介 素21的K562細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)；

(3)在培養(yǎng)的后續(xù)過程中，添加所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟(1)所述跨 膜結(jié)合蛋白為白介素21的K562細(xì)胞；

(4)離心，收集NK細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)、步驟(2’)和步 驟(3)同時(shí)另外加入CD16單克隆抗體；

優(yōu)選地，所述CD16單克隆抗體的濃度為20～40ng/mL。