[發明專利]一種基于仿生學的組織工程骨的制備方法

在審

• 申請號: 201610056304.9
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105617462A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 周益;沈建偉;關曉旭;王慧明
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;A61L27/56
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

技術領域

本發明屬于生物醫用材料領域，尤其涉及為一種如何基于“仿生學”及“自主裝原 理”制備組織工程骨的新方法。

背景技術

骨缺損的功能性修復重建一直是當前的重要研究課題。骨組織工程作為骨重建/ 替代治療的一種有效手段，其研究的關鍵因素包括種子細胞、支架材料和誘導調節因子等 三個方面。目前骨替代材料可大體分為三類：自體骨、以無機材料或/和有機材料合成的人 工替代材料以及由異體骨加工而來的衍生骨支架材料。自體骨由于無免疫原性且具有良好 的骨誘導性、骨引導性及完美的力學匹配性而成為骨缺損修復最佳的選擇。但是由于自體 骨來源有限、取材量小且容易造成供體部位的功能障礙以及由此引發的并發癥和不良后果 影響著它們在臨床上的大量運用。而人工合成的支架材料存在較差的生物相容性、生物活 性、生物降解性及與宿主骨的力學匹配性等問題。另外，孔隙率和孔隙大小等方面也難以模 仿天然骨的特性；而且有些材料的酸性降解產物還影響到細胞的附著、增殖和分化。因此， 異體來源的衍生骨支架材料，為我們提供了希望和解決問題的思路。由于這些支架材料來 源廣闊、擁有天然骨相似的結構、力學性能和生物學功能，并且它們可加工成各種大小和形 狀的骨塊可以滿足臨床手術中對支架多樣化的需求。在種子細胞選擇上，BMMSCs具有取材 方便、細胞量大、易于增殖分化及較好的免疫耐受性等特點。作為具有多向分化潛能的干細 胞，BMMSCs是組織工程骨理想的種子細胞。由于在體外無成骨誘導液的情況下，BMMSCs即可 發生自發成骨礦化現象。大量的體內研究也證實異位注入BMMSCs可在心肌、血管及軟骨內 發生礦化現象并形成可見的鈣結節。在選擇誘導調節因子上，不僅要考慮誘導因子具有促 進支架材料上細胞的成骨反應，還要考慮該因子具有促進支架材料的血管化反應或促進血 管化相關因子的表達。

發明內容

本發明的目的是針對現有“組織工程骨制備”存在的不足之處，提供一種基于“仿 生原理”的新型組織工程骨制備。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種基于仿生學的組織工程骨的制備 方法，包括以下步驟：

(1)將P3-5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h；其中孵育過程中，使用的培 養基為全培養基，孵育條件為37℃、含5％CO₂、飽和濕度；

(2)轉移至密閉的水套式CO₂細胞培養箱，每天換液，培養21天后獲得功能性組織 工程骨；培養過程中，使用的培養基為全培養基，培養條件為于37℃、飽和濕度、5％CO₂、5％ O₂、95％N₂。

進一步地，所述生物支架材料通過以下步驟制備得到：

(1.1)將帶有皮質骨的骨塊，用去離子水清洗后，用38℃的30vol％過氧化氫浸泡 脫脂24h；

(1.2)去離子水沖洗后，用4℃的0.6M鹽酸浸泡脫鈣4h；

(1.3)去離子水沖洗后，于乙醇中浸泡4h以去除剩余的過氧化氫；

(1.4)在室溫下用氯仿/甲醇的混合溶液(體積比1:1)浸泡處理1h；

(1.5)用4℃的0.25vol％胰蛋白酶(一般溶劑為PBS)浸泡處理12h，再用20～30℃ 的0.5vol％SDS(一般溶劑為PBS)浸泡處理4h，以脫蛋白；

(1.6)用4℃的0.6M鹽酸第二次浸泡脫鈣1h。

(1.7)去離子水沖洗后，在-38℃，10^-5Pa下冷凍干燥24h；

(1.8)利用⁶⁰Coγ-ray放射線照射，去除支架材料的抗原性。

進一步地，所述生物支架材料在孵育前，還用無菌的PBS浸泡24h，然后用無FBS的 L-DMEM浸泡2d，再用無菌的棉球或紗布吸除殘留的L-DMEM。

本發明的有益效果在于：

(1)本發明通過一系列復雜的“脫脂”、“脫蛋白”、并首創性地采用“二次脫礦法”制 備出無“免疫原性”、但卻保留良好“骨誘導性”并具有良好“生物相容性”的生物衍生骨支架 材料。

(2)BMMSCs具有取材方便、細胞量大、易于增殖分化及較好的免疫耐受性等特點。 由于在體外無成骨誘導液的情況下，BMMSCs可發生自發成骨礦化現象。因此還可免除調配 并加入成骨誘導液等繁復程序。