[發明專利]一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201610054517.8
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN107007832A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 潘海婷
• 申請（專利權）人: 中創云牧科技咨詢（北京）股份有限公司
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61P31/04;A61P15/14
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物基因技術領域，具體是一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法。

背景技術

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛的常見疾病，是奶牛乳腺組織的炎癥，主要為乳腺組織感染病原微生物所致，是奶牛的常見病、多發病。幾十年來，國內外針對奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但該病一直是困擾我國奶牛業養殖發展最為嚴重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖機能受到損傷，不僅降低奶牛的產奶量，使奶牛淘汰，影響乳的品質造成嚴重的經濟損失，嚴重時甚至影響到人類健康。

S.aμreus感染的第一步就是在宿主體內定植，而實現定植的前提是細菌在宿主的組織和細胞表面的黏附，細菌有可以黏附到組織表面的組分成為黏附素，S.aureus黏附素有纖維蛋白原凝集素A、B(Fibronectin-binding proteins clumping factor A and B，ClfA，ClfB)，纖維蛋白A、B(Fibronectin-binding protein A and B，FnBPA，FnBPB)，膠原結合蛋白(collagen-binding protein Can)和A蛋白(protein A)，ClfA是金黃色葡萄球菌主要的黏附素之一，能夠介導金黃色葡萄球菌結合于細胞表面的纖維素連接蛋白原，使細菌黏附于宿主細胞表面，促進細胞對寄主組織的入侵。ClfA是將細菌黏附到纖維蛋白和可溶及不溶性纖維蛋白原上的決定性因子。

發明內容

本發明的目的在于提供一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，由以下步驟組成：

1)重組質粒pET-ClfA-A的構建

提取金黃色葡萄球菌DNA，根據GenBank上已提交的ClfA基因序列，分別設計上游引 物與下游引物，且向上游引物與下游引物中分別引入Bam HI和Hind III酶切位點，制得重組質粒pET-ClfA-A；

上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，

下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，

然后對重組質粒pET-ClfA-A進行PCR擴增，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測；經藍白斑篩選及雙酶切鑒定得到的陽性克隆進行序列測定分析；

2)誘導的表達產物

將上述重組質粒pET-ClfA-A轉入感受態細胞BL21(DE3)中，用終濃度為0.8-1.2mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)進行誘導，取不同時間段的表達產物進行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測；

3)目的蛋白的大量表達及純化

根據SDS-PAGE檢測確定的最佳誘導時間和IPTG的濃度，對目的蛋白進行大量表達和純化；

4)免疫動物的篩選

選取體重2～2.5kg家兔，免疫后采血獲取血清，進行檢測；

5)免疫程序：

首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多點注射；

首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血獲取血清，測定抗體效價后，制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

作為本發明進一步的方案：PCR擴增條件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35個循環；72℃10min。

作為本發明進一步的方案：步驟2)中IPTG的終濃度為1.0mM。

作為本發明進一步的方案：首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每 只家兔注射700μg目的蛋白。

作為本發明進一步的方案：首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔300μg目的蛋白。

根據上述方法制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明建立的有效的金黃色葡萄球菌凝集因子蛋白(ClfA-A)的制備，為以ClfA-A為靶位的疫苗研究，對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供試驗依據。

附圖說明