[發明專利]一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201610054517.8
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN107007832A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 潘海婷
• 申請（專利權）人: 中創云牧科技咨詢（北京）股份有限公司
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61P31/04;A61P15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于，由以下步驟組成：

1)重組質粒pET-ClfA-A的構建

提取金黃色葡萄球菌DNA，根據GenBank上已提交的ClfA基因序列，分別設計上游引物與下游引物，且向上游引物與下游引物中分別引入Bam H I和Hind III酶切位點，制得重組質粒pET-ClfA-A；

上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，

下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，

然后對重組質粒pET-ClfA-A進行PCR擴增，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測；經藍白斑篩選及雙酶切鑒定得到的陽性克隆進行序列測定分析；

2)誘導的表達產物

將上述重組質粒pET-ClfA-A轉入感受態細胞BL21(DE3)中，用終濃度為0.8-1.2mM的IPTG進行誘導，取不同時間段的表達產物進行SDS-PAGE檢測；

3)目的蛋白的大量表達及純化

根據SDS-PAGE檢測確定的最佳誘導時間和IPTG的濃度，對目的蛋白進行大量表達和純化；

4)免疫動物的篩選

選取體重2～2.5kg家兔，免疫后采血獲取血清，進行檢測；

5)免疫程序：

首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多點注射；

首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血獲取血清，測定抗體效價后，制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

2.根據權利要求1所述的ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法， 其特征在于，PCR擴增條件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min 30s，35個循環；72℃10min。

3.根據權利要求1所述的ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)中IPT6的終濃度為1.0mM。

4.根據權利要求1所述的ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于，首次免疫：目的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，每只家兔注射700μg目的蛋白。

5.根據權利要求1所述的ClfA-A靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于，首次免疫后每隔15d加強免疫一次，以弗氏不完全佐劑為佐劑，每只家兔300μg目的蛋白。

6.根據權利要求1-5任一所述的制備方法制得金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。