[發(fā)明專(zhuān)利]鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610053758.0
• 申請(qǐng)日: 2016-01-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105582531B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘頻華;李海濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/104
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/104;A61P31/04;C12N15/70
• 代理公司: 長(zhǎng)沙市融智專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

1.鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗，其特征在于，是由如SEQ ID No .1所示的鮑曼不動(dòng)桿菌SmpA和如SEQ ID No .2所示的鮑曼不動(dòng)桿菌PLD核酸序列，分別連入表達(dá)載體，分別構(gòu)建SmpA和PLD重組質(zhì)粒，分別誘導(dǎo)表達(dá)重組SmpA和PLD蛋白，再將兩種蛋白混合佐劑制備的疫苗；

所述的鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗的制備方法：(1)根據(jù)SmpA、PLD基因序列，設(shè)計(jì)合成SmpA、PLD序列引物，在兩端引物分別引入NdeⅠ和Xho Ⅰ的酶切位點(diǎn)，PCR合成SmpA和PLD基因；(2)回收純化PCR產(chǎn)物，TA克隆至載體pMD 18-T，構(gòu)建克隆載體pMD 18-SmpA和pMD18- PLD ,并將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定測(cè)序； (3)用Nde I和Xho I雙酶切測(cè)序正確的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，與經(jīng)同樣酶切的pET28b質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E .coli BL21(DE3)中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子； (4)將陽(yáng)性單菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組SmpA和重組PLD 蛋白； (5)SDS-PAGE和WesternBlotting分析鑒定重組蛋白； (6)采用離子交換層析法純化重組蛋白并去除內(nèi)毒素； (7)重組的SmpA蛋白和重組PLD蛋白混合后，再與佐劑混合制備疫苗；

步驟(7)是將重組的SmpA蛋白25μg和重組PLD蛋白5μg混合后，再與1％氫氧化鋁溶液按質(zhì)量比1：1混合制備疫苗。